模擬分子對接 (molecular docking)

將OSU03013 當 ligand，PKA 蛋白當作 target，對於已知的 ATP binding site 使用生物資訊軟體 Autodock 作 docking 模擬實驗，先定義 出target protein binding site；再旋轉 ligand 的鍵角，產生新的構形。

根據Ligand 與 target protein binding site 的形狀比對，以及 ligand 方向 的變更，計算何種構形可以被計分。此計分方法是以 DockScore 軟 體，計算該構形的內能，以及該構形與目標蛋白質之間的能量(包括 凡得瓦力及靜電力) 決定出 Ligand 與 target protein binding site 最有可 能的結合方式與參與之胺基酸。

伍、結果

1. 藥物 OSU03013 處理肺癌細胞株 A549、CL1-1 及 H1435 的細胞形態

在光學顯微鏡下，正常的肺癌細胞 A549、CL1-1 及 H1435 其細 胞形態是貼住培養基盤底的，當細胞死亡時，細胞的型態或碎片會懸 浮在培養基中。在藥物OSU03013 的影響下，三種模式細胞皆可觀察 到有明顯死亡的現象 (Fig 3)。

2. 利用藥物 OSU03013 處理正常肺細胞株 MRC5 及肺癌細胞株 A549、CL1-1 及 H1435 並探討其藥物毒殺性

利用 Trypan Blue 染色法對細胞進行細胞計數，測量藥物 OSU03013 對肺正常細胞 MRC5 及肺癌細胞 A549、CL1-1、H1435 的 細胞毒殺性。處理 OSU03013 經 48 小時之後，測得 IC50 的濃度分 別為A549 (1.53μM)，CL1-1 (1.93μM)，H1435 (3.50μM)，這些劑量對 於肺正常細胞MRC5 並無明顯的毒殺作用 (Fig 4)。

3. OSU03013 導致細胞週期在間期一停滯 (Gap 1, G1 arrest) 及早期 的細胞凋亡 (early apoptosis)

從藥物 OSU03013 對模式細胞的細胞毒殺實驗可發現，處理藥 物後的細胞有凋亡 (apoptosis) 及壞疽 (necrosis) 的現象。因此我們

利 用 細 胞 流 式 儀 來 探 討 OSU03013 影 響 細 胞 死 亡 的 機 制 。 在 OSU03013 處理細胞 0、24、48 小時之後，我們發現細胞週期 G1 期

的細胞數目有隨著處理藥物後的時間延長而增加，三種模式細胞 A549、CL1-1 及 H1435 在處理藥物 48 小時其 G1 時期細胞數目分別

為83.5%、70.3% 以及 87.4% (Fig 5A)。

除此之外，細胞分裂期 (M phase) 標記蛋白 p-CDC2 在藥物處 理模式細胞後也有磷酸化表現量上升的趨勢 (Fig 5B)，有研究指出在 CDC2 的胺基酸序列 Tyr 15 位置磷酸化，CDC2 活性會被抑制，導致 細胞週期停滯在G1 期而無法進行細胞分裂 M 時期，此結果與本研究 在 流 式 細 胞 儀 所 偵 測 到 的 G1 arrest 現象相吻合 [Hunter, 1995;

Watanabe et al., 1995]。

本研究亦以早期細胞凋亡標記 (phosphotidylserine, PS) 外染的 技術來偵測細胞凋亡的鑑別。PS 位於細胞膜內側，當細胞被引發細

胞凋亡時，因為細胞膜會外翻，因此 PS 會在細胞表面被偵測到 [Williamson and Schlegel, 2004]。處理藥物 OSU03013 後，三種模式

細胞的 PS 染色，利用螢光顯微鏡皆可看見明顯的 PS 抗體染上處理 藥物後的細胞膜 (Fig 5C)。

4. 肺癌細胞株 A549、H1435、CL1-1 處理 OSU03013 引發內質網壓 力效應（endoplasmic reticulum, ER stress）

當細胞遭受持續或是有大量的內質網壓力效應時，亦會驅使細 胞凋亡的發生。在內質網壓力所引發的細胞凋亡過程中PERK、eIF2α 的磷酸化，及其下游蛋白GADD34 活化，其蛋白質表現量皆會增加，

再者，內質網壓力效應也會藉由活化caspase 12 而引發細胞凋亡。本 研究三種模式細胞在處理OSU03013 後，這些會因內質網壓力而引發 細胞凋亡相關的蛋白質，phosopho-PERK、phosopho-eIF2α、GADD34 的表現量皆有不同程度的上升，而caspase 12 也在藥物處理後也有從 不活化態被切成活化態的情形 (Fig 6)。

5. 利用蛋白質體學方法來尋找藥物處理細胞後的目標及影響蛋白

我們透過蛋白質體學的方法來探討 OSU03013 藥物對肺癌細胞 CL1-1、H1435 所產生的蛋白質體表現之影響。分別將 CL1-1、H1435 細胞株以pH 3～10 非線性 non-linear (NL)、pH 3～10 及 pH 4～7 線 性膠條進行一維及之後的二維電泳來做初步篩選。電泳分析結果將蛋 白質完全依造它們的等電點及分子量不同而分離，膠體上的每一個點 代表一個蛋白質，之後會對這些點進行蛋白質與鑑定。此實驗的目的 在分析肺癌細胞株處理藥物前後的蛋白質表現差異，藥物處理後肺癌 細胞表現量高的蛋白我們定義為藥物處理後被 OSU03013 所誘導的 蛋白，藥物處理後表現量低的蛋白我們定義為肺癌細胞被 OSU03013

所抑制的蛋白。(Fig 7A) 以 500μg 之萃取蛋白為二維電泳分析，使用 SyproRubyb 染色，利用 ImageMaster 軟體分析，我們可以看出藥物處

理前後表現量有差異的蛋白質點，再將這些表現差異大於兩倍的蛋白 質點做膠體水解 (in-gel digestion)，利用 trypsin 水解後的蛋白質進行 質譜分析，利用 MALDI-Q-TOF 所得到的分析結果，透過 Mascot 網 站做蛋白質的鑑定，一共鑑定了204 個蛋白質點，保留了比對後可信 度高的蛋白及去除角蛋白 (keratin) 後 (因 keratin 蛋白多為二維電泳 常見之非專一性蛋白)，整理成表 (Table 1 and Table 2)，這些蛋白包

含了cAMP protein kinase inhibitor β (PKIB, 激酶抑制蛋白)、數種 G proteins (G 蛋白)、數種 Heat-shock proteins (熱休克蛋白)、Antioxidant enzymes (去氧化蛋白)、及其他調控細胞生長、代謝的蛋白質。之後 以西方點墨法來更加確認蛋白質鑑定的精準度 (Table 3)。一些 OSU03013 處理 48 小時後表現量會下降的蛋白如：Annexin A3、

α-tubulin、HSP27、HSP70、HSP90，在西方點墨法的實驗結果與蛋 白質體學鑑定的結果一致 (Fig 7B)。

6. 藥物 OSU03013 與 PKA 的分子對接 (Molecular Docking)

研究發現PKA 是調控細胞增殖一個很重要的蛋白 [Masai et al., 2005]，而在我們利用蛋白質體學的方法去尋找藥物 OSU03013 在肺

癌細胞的目標蛋白質結果中，因為PKIB 的過度活化 (Table 2)，我們 預測其下游蛋白cAMP-dependent protein kinase (PKA) 的蛋白表現量 在處理藥物後會下降，之後透過 Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK3β) 的調控路徑去調控 β-catenin，使得身為轉錄協同因子的 β-catenin 蛋白表現下降。利用西方點墨法，本研究證實了 PKA 的蛋

白表現的確下降，進而影響 GSK3β之磷酸化下降，而導致 β-catenin 蛋白的表現下降 (Fig 8A)。而在 OSU03013 與 PKA 蛋白質結構之分 子對接 (Molecular Docking) 的電腦模擬中發現，OSU03013 可以穩 定的對接在PKA 的 ATP binding site 上 (Fig 8B)。

陸、討論

肺癌在國人癌症死亡率一直都是居高不下的，歸咎其原因不外 乎是其癌症本身的高轉移率以及對傳統化療藥物的高抗藥性，所以近 年來新藥的開發一直是癌症研究中一個很重要的課題。OSU03013 是 celecoxib 的結構修飾物，celecoxib 長久以來一直被用來治療關節炎，

它為 COX-2 的抑制劑 [Zhu et al., 2002]；在近年來的研究中發現 OSU03013 對於攝護腺癌及乳癌有抑制的效果 [Song et al., 2002]。本 研究以細胞模式證明了 OSU03013 亦可針對肺癌細胞透過內質網壓 力效應，引發細胞凋亡，並且為第一篇以蛋白質體學的方法去偵測 OSU03013 對於肺癌細胞的目標蛋白，並針對藥物的目標蛋白探討其 分子機制。

對於肺正常細胞而言，OSU03013 並不會造成細胞的毒殺作用，

但 是 對 於 癌 細 胞 ，OSU03013 的 毒 殺 作 用 比 傳 統 癌 症 治 療 藥 物 cisplatin 有更好的效果，cisplatin 的 IC50 在各種肺癌細胞分別為：A549 (6.35μM)、CL1-1 (8.76μM)、H1435 (21.78μM)，相較於 OSU03013 的 IC50 遠低於 cisplatin，特別是 A549 (1.53μM) 及 CL1-1(1.93μM) 這 兩株肺癌細胞，其 IC50 甚至低於 2μM，所以，OSU03013 在肺癌的 治療藥物中，是一種非常有潛力的藥物。

在模式細胞處理藥物 OSU03013 之後，細胞週期蛋白 Cell division cycle 2 (CDC2) 胺基酸序列 Tyr 15 位置被磷酸化的現象增

加，因此CDC2 的活性會被抑制，導致細胞無法從 G2/M 的細胞週期 關卡 (checkpoint) 進入細胞分裂期；另外，利用流式細胞儀實驗結果 發現，在 G1 時期的細胞隨著藥物處理後的時間增加而細胞比例增 加，顯示細胞在處理藥物後細胞週期停滯在G1 時期（相對的細胞分 裂期也較少），結果顯示 OSU03013 除了會造成細胞的毒殺作用以 外，它亦會造成肺癌細胞的生長遲滯。

細胞的死亡不外乎細胞凋亡 (apoptosis) 及細胞壞疽 (necrosis) 的現象；本研究發現，OSU03013 處理細胞後利用 PS 的染色技術觀 察到細胞膜的外翻現象，此一現象為早期apoptosis 的現象。

目前已知誘發細胞凋亡的作用途徑主要有三大類，包含透過活 化細胞膜上的死亡受體的外在路徑、藉由粒線體調控的內在路徑，以 及誘發內質網氧化壓力效應所調控的內質網路徑 [Nakagawa et al., 2000; Remillard and Yuan, 2004]。在本研究中發現，Caspase 12 在藥

物處理細胞後有從不活化態轉變成活化態的情形，而Caspase 12 為內 質網壓力效應一個重要的指標。Nakagawa 等人發現 caspase 12 會和 78-kDa glucose- regulated protein (grp78)、presenilin-2 及 β-amyloid

precursor protein (APP) 一同存在於內質網 [Nakagawa et al., 2000]。

經 Nakagawa 等人實驗證實得知 caspase-12 與 APP 被切割形成 Aβ (amyloid-β) 有關聯；然而，有文獻指出 APP 是 caspase-3 專一性的 受質 [Gervais et al., 1999]，故 Nakagawa 等人推測 caspase-3 可能是 caspase 12 下游路徑調控的受質之一，至於是否有 Bcl-2 family 成員 參與其中或 caspase 12 之一般正常生理調控機制皆尚未明確。除了 caspase 12 以外，本研究也利用了 p-PERK、p-eIF2α 以及 GADD34

等內質網路徑相關蛋白，來證明OSU03013 所引發的細胞凋亡現象為 內質網的壓力效應。當內質網受到壓力效應時 PERK 會磷酸化成 p-PERK，進而使下游的 eIF2α 磷酸化成 p-eIF2α 以及 GADD34 表 現上升，造成細胞的凋亡。

為了尋找肺癌細胞受藥物OSU03013 所影響的其他蛋白質，我們使 用蛋白質體學的方法去偵測藥物處理前後的細胞內蛋白質，發現包含了 與細胞分裂、細胞週期有關的 α-tubulin 及 CDC2；熱休克蛋白 (heat shock protein) HSP27、HSP70 及 HSP90；與磷酸化肌醇 (inositol) 代謝 酵素相關的蛋白Annexin A3；與 cAMP-protein kinase (PKA) 訊息傳遞路 徑相關的蛋白cAMP-protein kinase inhibitor (PKIB, 激酶抑制蛋白 B)；及 與 Wnt/β-catenin 調控路經相關蛋白 Glycogen synthase kinase-3 beta

在Dr. Chen 的實驗中，OSU03013 針對攝護腺癌有很大的腫瘤抑 制效果；在攝護腺癌細胞實驗中 OSU03013 抑制 AKT 上游 PDK1，

藥物有效的降低AKT 磷酸化的現象，使原本不易死亡的攝護腺癌細 胞死亡率提升，並且加強了細胞凋亡的情形發生；其在 OSU03013 與AKT 之分子對接實驗結果，也間接的證實了 OSU03013 藥物可以 進入細胞內，進而與細胞質蛋白結合。本研究利用 OSU03013 處理的 肺癌細胞，其PDK1 或是 AKT 的蛋白表現量在西方點墨法實驗中並 無明顯的表現差異 (data not shown)；反而在蛋白質體學實驗中，發 現了 PKIB 為在處理藥物後表現量增加的一個蛋白質點；PKIB 會去 抑制PKA 的表現 [Van Patten et al., 1997]，PKA 信息傳遞路徑為細胞 生長時一個重要的路徑，在西點墨法的實驗中，我們也發現了 PKA 的表現在肺癌細胞處理藥物後有下降的趨勢。另外，在 OSU03013 與 PKA 的分子對接模擬實驗中，本研究預測 OSU03013 會進入細胞 與ATP 分子競爭 PKA 蛋白質上的 ATP binding site，此為 PKA 的活

藥物有效的降低AKT 磷酸化的現象，使原本不易死亡的攝護腺癌細 胞死亡率提升，並且加強了細胞凋亡的情形發生；其在 OSU03013 與AKT 之分子對接實驗結果，也間接的證實了 OSU03013 藥物可以 進入細胞內，進而與細胞質蛋白結合。本研究利用 OSU03013 處理的 肺癌細胞，其PDK1 或是 AKT 的蛋白表現量在西方點墨法實驗中並 無明顯的表現差異 (data not shown)；反而在蛋白質體學實驗中，發 現了 PKIB 為在處理藥物後表現量增加的一個蛋白質點；PKIB 會去 抑制PKA 的表現 [Van Patten et al., 1997]，PKA 信息傳遞路徑為細胞 生長時一個重要的路徑，在西點墨法的實驗中，我們也發現了 PKA 的表現在肺癌細胞處理藥物後有下降的趨勢。另外，在 OSU03013 與 PKA 的分子對接模擬實驗中，本研究預測 OSU03013 會進入細胞 與ATP 分子競爭 PKA 蛋白質上的 ATP binding site，此為 PKA 的活