我們透過蛋白質體學的方法來探討 OSU03013 藥物對肺癌細胞 CL1-1、H1435 所產生的蛋白質體表現之影響。分別將 CL1-1、H1435 細胞株以pH 3～10 非線性 non-linear (NL)、pH 3～10 及 pH 4～7 線 性膠條進行一維及之後的二維電泳來做初步篩選。電泳分析結果將蛋 白質完全依造它們的等電點及分子量不同而分離，膠體上的每一個點 代表一個蛋白質，之後會對這些點進行蛋白質與鑑定。此實驗的目的 在分析肺癌細胞株處理藥物前後的蛋白質表現差異，藥物處理後肺癌 細胞表現量高的蛋白我們定義為藥物處理後被 OSU03013 所誘導的 蛋白，藥物處理後表現量低的蛋白我們定義為肺癌細胞被 OSU03013
所抑制的蛋白。(Fig 7A) 以 500μg 之萃取蛋白為二維電泳分析，使用 SyproRubyb 染色，利用 ImageMaster 軟體分析，我們可以看出藥物處
理前後表現量有差異的蛋白質點，再將這些表現差異大於兩倍的蛋白 質點做膠體水解 (in-gel digestion)，利用 trypsin 水解後的蛋白質進行 質譜分析，利用 MALDI-Q-TOF 所得到的分析結果，透過 Mascot 網 站做蛋白質的鑑定，一共鑑定了204 個蛋白質點，保留了比對後可信 度高的蛋白及去除角蛋白 (keratin) 後 (因 keratin 蛋白多為二維電泳 常見之非專一性蛋白)，整理成表 (Table 1 and Table 2)，這些蛋白包
含了cAMP protein kinase inhibitor β (PKIB, 激酶抑制蛋白)、數種 G proteins (G 蛋白)、數種 Heat-shock proteins (熱休克蛋白)、Antioxidant enzymes (去氧化蛋白)、及其他調控細胞生長、代謝的蛋白質。之後 以西方點墨法來更加確認蛋白質鑑定的精準度 (Table 3)。一些 OSU03013 處理 48 小時後表現量會下降的蛋白如：Annexin A3、
α-tubulin、HSP27、HSP70、HSP90，在西方點墨法的實驗結果與蛋 白質體學鑑定的結果一致 (Fig 7B)。
6. 藥物 OSU03013 與 PKA 的分子對接 (Molecular Docking)
研究發現PKA 是調控細胞增殖一個很重要的蛋白 [Masai et al., 2005]，而在我們利用蛋白質體學的方法去尋找藥物 OSU03013 在肺
癌細胞的目標蛋白質結果中，因為PKIB 的過度活化 (Table 2)，我們 預測其下游蛋白cAMP-dependent protein kinase (PKA) 的蛋白表現量 在處理藥物後會下降，之後透過 Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK3β) 的調控路徑去調控 β-catenin，使得身為轉錄協同因子的 β-catenin 蛋白表現下降。利用西方點墨法，本研究證實了 PKA 的蛋
白表現的確下降，進而影響 GSK3β之磷酸化下降，而導致 β-catenin 蛋白的表現下降 (Fig 8A)。而在 OSU03013 與 PKA 蛋白質結構之分 子對接 (Molecular Docking) 的電腦模擬中發現，OSU03013 可以穩 定的對接在PKA 的 ATP binding site 上 (Fig 8B)。
陸、討論
肺癌在國人癌症死亡率一直都是居高不下的，歸咎其原因不外 乎是其癌症本身的高轉移率以及對傳統化療藥物的高抗藥性，所以近 年來新藥的開發一直是癌症研究中一個很重要的課題。OSU03013 是 celecoxib 的結構修飾物，celecoxib 長久以來一直被用來治療關節炎，
它為 COX-2 的抑制劑 [Zhu et al., 2002]；在近年來的研究中發現 OSU03013 對於攝護腺癌及乳癌有抑制的效果 [Song et al., 2002]。本 研究以細胞模式證明了 OSU03013 亦可針對肺癌細胞透過內質網壓 力效應，引發細胞凋亡，並且為第一篇以蛋白質體學的方法去偵測 OSU03013 對於肺癌細胞的目標蛋白，並針對藥物的目標蛋白探討其 分子機制。
對於肺正常細胞而言，OSU03013 並不會造成細胞的毒殺作用，
但 是 對 於 癌 細 胞 ，OSU03013 的 毒 殺 作 用 比 傳 統 癌 症 治 療 藥 物 cisplatin 有更好的效果，cisplatin 的 IC50 在各種肺癌細胞分別為：A549 (6.35μM)、CL1-1 (8.76μM)、H1435 (21.78μM)，相較於 OSU03013 的 IC50 遠低於 cisplatin，特別是 A549 (1.53μM) 及 CL1-1(1.93μM) 這 兩株肺癌細胞，其 IC50 甚至低於 2μM，所以，OSU03013 在肺癌的 治療藥物中，是一種非常有潛力的藥物。
在模式細胞處理藥物 OSU03013 之後，細胞週期蛋白 Cell division cycle 2 (CDC2) 胺基酸序列 Tyr 15 位置被磷酸化的現象增
加，因此CDC2 的活性會被抑制，導致細胞無法從 G2/M 的細胞週期 關卡 (checkpoint) 進入細胞分裂期；另外，利用流式細胞儀實驗結果 發現，在 G1 時期的細胞隨著藥物處理後的時間增加而細胞比例增 加，顯示細胞在處理藥物後細胞週期停滯在G1 時期（相對的細胞分 裂期也較少），結果顯示 OSU03013 除了會造成細胞的毒殺作用以 外，它亦會造成肺癌細胞的生長遲滯。
細胞的死亡不外乎細胞凋亡 (apoptosis) 及細胞壞疽 (necrosis) 的現象；本研究發現，OSU03013 處理細胞後利用 PS 的染色技術觀 察到細胞膜的外翻現象，此一現象為早期apoptosis 的現象。
目前已知誘發細胞凋亡的作用途徑主要有三大類，包含透過活 化細胞膜上的死亡受體的外在路徑、藉由粒線體調控的內在路徑，以 及誘發內質網氧化壓力效應所調控的內質網路徑 [Nakagawa et al., 2000; Remillard and Yuan, 2004]。在本研究中發現，Caspase 12 在藥
物處理細胞後有從不活化態轉變成活化態的情形，而Caspase 12 為內 質網壓力效應一個重要的指標。Nakagawa 等人發現 caspase 12 會和 78-kDa glucose- regulated protein (grp78)、presenilin-2 及 β-amyloid
precursor protein (APP) 一同存在於內質網 [Nakagawa et al., 2000]。
經 Nakagawa 等人實驗證實得知 caspase-12 與 APP 被切割形成 Aβ (amyloid-β) 有關聯；然而，有文獻指出 APP 是 caspase-3 專一性的 受質 [Gervais et al., 1999]，故 Nakagawa 等人推測 caspase-3 可能是 caspase 12 下游路徑調控的受質之一，至於是否有 Bcl-2 family 成員 參與其中或 caspase 12 之一般正常生理調控機制皆尚未明確。除了 caspase 12 以外，本研究也利用了 p-PERK、p-eIF2α 以及 GADD34
等內質網路徑相關蛋白，來證明OSU03013 所引發的細胞凋亡現象為 內質網的壓力效應。當內質網受到壓力效應時 PERK 會磷酸化成 p-PERK，進而使下游的 eIF2α 磷酸化成 p-eIF2α 以及 GADD34 表 現上升，造成細胞的凋亡。
為了尋找肺癌細胞受藥物OSU03013 所影響的其他蛋白質，我們使 用蛋白質體學的方法去偵測藥物處理前後的細胞內蛋白質，發現包含了 與細胞分裂、細胞週期有關的 α-tubulin 及 CDC2；熱休克蛋白 (heat shock protein) HSP27、HSP70 及 HSP90；與磷酸化肌醇 (inositol) 代謝 酵素相關的蛋白Annexin A3；與 cAMP-protein kinase (PKA) 訊息傳遞路 徑相關的蛋白cAMP-protein kinase inhibitor (PKIB, 激酶抑制蛋白 B)；及 與 Wnt/β-catenin 調控路經相關蛋白 Glycogen synthase kinase-3 beta
在Dr. Chen 的實驗中，OSU03013 針對攝護腺癌有很大的腫瘤抑 制效果；在攝護腺癌細胞實驗中 OSU03013 抑制 AKT 上游 PDK1，
藥物有效的降低AKT 磷酸化的現象，使原本不易死亡的攝護腺癌細 胞死亡率提升，並且加強了細胞凋亡的情形發生；其在 OSU03013 與AKT 之分子對接實驗結果，也間接的證實了 OSU03013 藥物可以 進入細胞內，進而與細胞質蛋白結合。本研究利用 OSU03013 處理的 肺癌細胞，其PDK1 或是 AKT 的蛋白表現量在西方點墨法實驗中並 無明顯的表現差異 (data not shown)；反而在蛋白質體學實驗中，發 現了 PKIB 為在處理藥物後表現量增加的一個蛋白質點；PKIB 會去 抑制PKA 的表現 [Van Patten et al., 1997]，PKA 信息傳遞路徑為細胞 生長時一個重要的路徑，在西點墨法的實驗中，我們也發現了 PKA 的表現在肺癌細胞處理藥物後有下降的趨勢。另外，在 OSU03013 與 PKA 的分子對接模擬實驗中，本研究預測 OSU03013 會進入細胞 與ATP 分子競爭 PKA 蛋白質上的 ATP binding site，此為 PKA 的活 化區，被 OSU03013 結合的 PKA 其蛋白質活性會下降。在 PKA 蛋白 質表現下降或活性降低的肺癌細胞中，PKA 下游的轉錄因子 cAMP response element binding protein (CREB) 就無法被活化，導致細胞生 長的停滯 (Fig 9)。在過去的研究中 Wnt/β-catenin 調控路徑在肺癌的 病人及細胞是過度活化的，本研究也發現了與 Wnt/β-catenin 有關的
蛋白質 p-GSK3β 在藥物處理後的細胞蛋白表現下降，非磷酸化的 GSK3β 會與 β-catenin 以及 Axin 形成一個複合體，進而使 β-catenin
被分解，導致 β-catenin 的協同轉錄作用不再進行，造成細胞不再生 長 [Mazieres et al., 2005; Masai et al., 2005]。由上述實驗結果我們預 測 OSU03013 在肺癌細胞的作用是使 PKA 在細胞內的表現量或蛋白 活性下降，表現量或活性下降的 PKA 除了影響其下游蛋白 CREB 外，它還讓 β-catenin 無法正常進入細胞核執行轉錄協同作用，最終 導致整個細胞的生長停滯；所以我們預測OSU03013 在低劑量濃度處 理肺癌細胞後，抑制細胞生長的調控路徑為 PKA 調控路徑，非經由 AKT 的調控抑制所致，肺癌細胞經 OSU03013 處理非由 AKT 調控抑 制的現象也在Tong Z 等人 [2006] 的研究中證實。Tong Z 等人的研 究中以 A549 為模式細胞，藥物劑量為 10μM，而細胞死亡的途徑為 cytochrome c 所引發的細胞凋亡。所以在肺癌細胞中，處理 OSU03013 的劑量不同，所影響的細胞生長及死亡的路徑就有可能不相同。
柒、結論與未來工作
一、結論
1. 由於藥物 OSU03013 對肺癌細胞的細胞毒殺作用比一般傳統化療 藥物 (cisplatin) 強，而且對於正常的肺細胞沒有毒殺作用，所以
本研究認為OSU03013 是一個非常值得開發的肺癌新穎抗癌藥物。
2. 在處理低劑量 OSU03013 的三株肺癌細胞會導致細胞週期停滯在 G1 時期，以及因為藥物造成內質網壓力效應 (ER stress) 而有細 胞凋亡 (apoptosis) 的現象。
3. 由蛋白質體學的實驗中，本研究預測 OSU03013 會藉由 PKA 及 Wnt/β-catenin 的這兩條訊息調控路徑去調控細胞，以達到抑制肺 癌細胞生長的效果。
二、未來工作：
1. 藉由肺癌細胞處理 OSU03013 在不同濃度以及處理後不同的時間
點下，探討PKA 活性變化的情形。
2. 在肺癌細胞株中建構一個 PKA 會過度表達的載體，探討在 PKA 蛋白的過度表現下，OSU03013 影響細胞的生長是否有改變。
3. 探討 PKA 下游蛋白質 CREB 及 c-Jun 在藥物 OSO03013 處理後，
蛋白質表現的情形。
4. 利用抑制 PKA 上游 adenylyl cyclase 或 cAMP 的抑制劑來探討 OSU03013 的細胞毒殺作用是否增強。
5. 找尋 PKA 訊息調控路徑的抑制劑，例如 H89 及 KT5720，進而研 究PKA 的抑制劑在肺癌的抑癌效果，及是否有潛力成為新一代的 肺癌治療藥物。
6. 找尋其他被 OSU03013 抑制的蛋白之抑制劑或化合物，進而研究 是否一樣有潛力可以成為新穎抗癌藥。
7. 利用動物實驗持續研究 OSU03013 在肺癌的抗癌效果，觀察在動 物實驗中，OSU03013 是否有與肺癌細胞相同的抑癌效果，進而研 究此藥物對其他臟器的影響以及其生理毒性。
8. 進入臨床試驗，分析及統計 OSU03013 在肺癌病人的治療效果，
評估是否可能成為一個新穎的治療藥物或複合藥物。