Purpose: Lung cancer is the leading cause of cancer death in many

國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文

肺癌新穎抗癌藥物 OSU03013 之

蛋白質體學研究及生長抑制之分子機制探討

Molecular mechanisms of cytotoxicity

and proteomics approach for potential anti-cancer drug OSU03013 in lung cancer

研究生：李昆學 (Kung-Hsueh Lee)

指導教授：王憶卿 博士 (Yi-Ching Wang)

中華民國九十六年七月

謝 誌

很幸運的在三年前跟隨了王憶卿教授進入了肺癌的研究領域，在老師的指 導下，對於肺癌有更深一部的了解。感謝老師對我的指導，使我在實驗設計及 邏輯思考上可以讓我的研究更為完善；感謝老師對我的教導，使我的口語表達 及文書能力進步了不少；感謝老師對我的教誨，使我對於看待每件事物的心態 及角度都有所不同。同時也要謝謝老師的體諒，讓我在研究之暇可以修習教育 學程。除了王憶卿老師，我也要謝謝口試委員李桂楨教授及阮雪芬教授，讓此 論文的完成更為嚴謹。

另外，我要感謝師大實驗室的伙伴們，謝謝若嘉、若凱學姊在實驗上的建 議；謝謝慶孝學長的鼓勵；謝謝哲維學長為實驗室的付出及對我電腦的救援；

感恩一泓學姊的帶領，帶領我征服我的研究論文，使我免於孤軍奮戰；謝謝信 銘、芳宜、世華的陪伴；謝謝學弟妹偉伶、家揚、素芬、一麟、翊萱、孝文、

逸萱、怡珊、衍儒、淨婷、珈鑫……、助理本翰、婷芸、喬凱……等等你們這 群好相處的好伙伴，也謝謝已經畢業離開實驗室的學長姊建智、曾傑、豐任學 長、明霓、司佩、金祝……學姊，在我還是蒙懂的學弟時給予我幫助及建議；

對了，還有謝謝Taffy 忠狗沒有假日二十四小時看守著實驗室。

除此之外，我也要感謝台大實驗室的成員們，感謝阮老師及黃老師讓我在 台大的實驗室學習到了有關「系統生物學」的相關知識及實驗技術；謝謝翠琴 學姊有耐心的跟我討論實驗的設計，謝謝建偉細心的把實驗技術教導給我；還 有謝謝已經畢業的昆杰和學弟妹正寶、佑偉、國欽、景耀、心儀、姿瑩、家維、

定遠、凱麟、奕瑄……等等在我實驗的壓力下帶給我歡笑；以及謝謝我在台大 及師大所認識的所有學長姊、學弟妹、朋友們。

最後，我要感謝的是我的家人，感謝疼我的爺爺、奶奶、能夠體諒我這三 年來家庭聚會的缺席；感謝愛我的爸爸、媽媽能夠讓我沒有後顧之憂的唸完碩 士班；謝謝百純，感謝妳能夠體諒我把陪你的時間拿來作實驗，希望未來我們

都能互相體諒，攜手成長。

寫完了謝誌，代表了碩士班生涯的結束，對於這三年充實的生活，充滿了 不捨，不捨著師長們的諄諄教誨，不捨著同窗的相隨。結束了碩士班的生活，

也意謂另一個階段的開始，我將帶著我著三年的所學、經驗及師長的教誨，自 信且嚴謹的進入我下一個人生的階段。

僅以此論文獻給我最親愛的家人、及所有我關心、關心我、一路相陪伴的 朋友們。

李昆學 謹誌于 國立台灣師範大學 生命科學研究所 中華民國九十六年八月

目 錄

肺癌新穎抗癌藥物 OSU03013 之

蛋白質體學研究及生長抑制之分子機制探討

Molecular mechanisms of cytotoxicity and proteomics approach for potential anti-cancer drug OSU03013 in lung cancer

壹、中文摘要……… 1

貳、英文摘要……… 3

叁、緒論……… 5

一、研究背景……… 5

1. 肺癌治療現況……… 5

2. 新穎抗癌藥物 OSU03013……… 5

3. 細胞 apoptosis 的分子機制……… 7

4. 藥物標的蛋白的研究……… 8

二、研究目的……… 13

肆、研究材料與方法……… 14

一、研究材料……… 14

1. 肺癌細胞株……… 14

2. Celecoxib 的結構修飾物 OSU03013……… 14

二、研究方法……… 15

1. 細胞培養……… 15

2. 藥物處理之細胞毒性分析……… 15

3. 細胞週期分析……… 16

4. phosphatidylserine (PS) 染色以偵測早期細胞凋亡…… 16

5. 細胞株蛋白質萃取……… 17

6. 蛋白質定量……… 17

7. 蛋白質體學……… 18

8. 西方點墨 (Westernblot)……… 21

9. 模擬分子對接 (molecular docking)……… 22

伍. 結果……… 23

1. 藥物 OSU03013 處理肺癌細胞株 A549、CL1-1 及 H1435… 23 的細胞形態 2. 利用藥物 OSU03013 處理正常肺細胞株 MRC5 及肺癌…… 23

細胞株A549、CL1-1 及 H1435 並探討其藥物毒殺性

3. OSU03013 導致細胞週期在間期一停滯 (Gap 1, G1 arrest)… 23 及早期的細胞凋亡 (early apoptosis)

4. 肺癌細胞株 A549、H1435、CL1-1 處理 OSU03013 引發… 24 內質網壓力效應（endoplasmic reticulum, ER stress）

5. 利用蛋白質體學方法來尋找藥物處理細胞後的目標……… 25

及影響蛋白 6. 藥物 OSU03013 與 PKA 的分子對接 (Molecular Docking)… 26 陸、討論……… 28

柒、結論與未來工作……… 33

捌、附表……… 35

玖、附圖……… 42

拾、參考文獻……… 55

拾壹、附 錄……… 61

TABLE CONTENT

Table 1 Proteins that were decreased expression in lung cancer …..36

cell lines treated with OSU03013 detected by MS and MS/MS

Table 2 Proteins that were overexpression in lung cancer cell ……39

lines treated with OSU03013 detected by MS and MS/MS

Table 3 The final selected proteins after lung cancer cell lines …...41 treated with OSU03013 for further studies

FIGURE CONTENT

Figure 1 The structure of celecoxib and OSU03013……… 43

Figure 2 (A) Three major apoptosis pathways (B) ER stress pathway……….44

Figure 3 Cell morphological observations……… 46

Figure 4 The cell cytotoxicity of OSU03013 treatment at 48 h……… 47

Figure 5 Cell cycle distribution assay (A) Flow cytometry analysis ……...… 48 (B) Western blot analysis. And (C) Early apoptosis detection

Figure 6 Western blot analysis of endoplasmic reticulum (ER) stress………. 50 related proteins

Figure 7 Representative figures (A) two-dimensional electrophoresis (2-DE)….. 51 electrophotograms and (B) Western blot analyses to confirm

the results

Figure 8 (A) Western blot analysis PKA dephosphorylation and……… 53 (B) Docking study of OSU03013 compound against PKA

Figure 9 The PKA signaling pathway model……… 54

ABBREVIATIONS

2-DE Two-dimensional gel electrophoresis Aβ amyloid-β

APP β-amyloid precursor protein

C Control

CDC2 Cell division cycle 2

COX-2 Cyclooxygenase-2

CREB cAMP response element binding protein DTE 1,4 Dithioerythritol

eIF2α Eukaryotic translational initiation factor-2α ER Endoplasmic reticulum

GADD34 Apoptosis-associated protein GADD34

G1 Gap 1

grp78 78-kDa glucose- regulated protein GSK3β Glycogen synthase kinase-3 beta HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution

HER Human epidermal growth factor receptor Hsp27 Heat-shock protein 27

Hsp70 Heat-shock protein 70 Hsp90 Heat-shock protein 90 IAA Iodoacetamide IEF Isoelectric focusing L Linear

MALDI Matrix assisted laser desorption/ionization MS Mass spectrometry

MW Molecular weight

NCBI National Center for Biotechnology Information NL Non-linear

PBS Phosphate-buffered saline PBS-T Phosphate-based saline-0.5% Tween-20

PDK1 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 PERK PRKR-like endoplasmic reticulum kinase PI Propidium Iodide

PKA cAMP-dependent protein kinase

PKIB cAMP-dependent protein kinase inhibitor β PS Phosphatidylserine

PVDF Polyvinylidene difluoride Q-TOF Quadrupole-TOF

SDS-PAGE Sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis T Treat

TOF Time of flight

壹、中文摘要

肺癌是國人最重要的癌症致死原因。肺癌病人通常在腫瘤切除 後五年內死於癌症復發或腫瘤轉移，大部分接受化學治療的肺癌患 者，常常因為對傳統化療藥物產生抗性而治療失敗，這些傳統化療 藥物的副作用也對病人造成極大的痛苦，因此需要新藥的發展以提 升肺癌患者的治癒率。近年來COX-2 的抑制劑，celecoxib，它的結 構修飾物 OSU03013，在攝護腺、卵巢癌、乳癌等，已經被研究有 抗癌的效果，並且是以 AKT 的訊息傳遞路徑來達到抑制攝護腺癌 之生長。因此，本研究目標即是探討OSU03013 在肺癌細胞之毒殺 作用及其細胞學鑑定，之後利用二維電泳、質譜分析等蛋白質體學 的方法找尋藥物的目標及影響蛋白，並分析這些蛋白/訊息傳遞路徑 與細胞生長調控的關係。

在肺癌細胞株 A549、CL1-1、H1435 的 IC50 測試實驗中，本 研究發現OSU03013 具有高度細胞毒殺作用，而此藥物對於肺正常 細胞並沒有此現象，所以我們認為它是一個治療肺癌很有潛力的藥 物。在細胞學鑑定實驗中，我們發現OSU03013 會造成細胞週期停 滯在間期一 (Gap 1, G1 arrest) 的現象；OSU03013 在肺癌細胞同時 也藉由內質網壓力效應去引發細胞凋亡 (apoptosis)。在蛋白質體學 的 實 驗 中 ， 我 們 發 現 此 藥 物 在 肺 癌 細 胞 之 目 標 蛋 白 包 含 了

cAMP-dependent protein kinase inhibitor β form (PKIB, 激酶抑制蛋 白)、數種 G proteins (G 蛋白)、數種 Heat-shock proteins (熱休克蛋 白)、Antioxidant enzymes (去氧化蛋白)、及其他調控細胞生長、代 謝的蛋白；這些蛋白有許多皆以Western blot (西方點墨法) 確認。

由於 OSU03013 在肺癌細胞中因為 PKIB 的過度活化，我們預測其 下游蛋白cAMP-dependent protein kinase (PKA) 的蛋白表現量在處 理藥物後會下降，以抑制PKA 的訊息傳導路徑，其中一條路徑抑制 了Wnt/β-catenin 活性，所以抑制了肺癌細胞生長；而並非如同在攝 護腺癌中，是透過 AKT 傳導路徑來抑制癌細胞的生長。本研究為 首篇在肺癌細胞中偵測OSU03013 藥物之抑制癌細胞潛力，及其抑 癌分子機轉之研究。

貳、英文摘要 Abstract

Purpose: Lung cancer is the leading cause of cancer death in many

countries including Taiwan. The majority of lung cancer patients receiving the chemo-therapy often fail because of drug resistance. In addition, patients suffer from side effects of current chemotherapies.

Therefore, developing the new therapeutic drugs is important and can greatly improve the cure rate of the lung cancer. Background:

OSU03013 is a modified compound from celecoxib, which is a COX-2 inhibitor used for arthritis treatment. OSU03013 has been shown to also act as an anti-cancer drug for prostate, breast, and ovary cancer though inhibition of AKT-mediated singling in cell and animal models.

Study design: To investigate whether OSU03013 can be a potential drug for

lung cancer treatment and to identify the molecular targets for OSU03013, we (1) screened the A549, CL1-1, and H1435 lung cancer cell lines for their IC50 treated with OSU03013, (2) investigated the cell cycle after OSU03013 treatment by flow cytometry, (3) studied the mechanism of cell apoptosis related to cytotoxicity effects of OSU03013, (4) identified target/effector proteins of OSU03013 by two-dimensional electrophoresis

and mass-spectrometry (2DE-MS), and (5) confirmed the selected proteins by Western blot analysis.

Results: The cytotoxicity of the

For example, PKIB is up-regulated after OSU03013 treatment, it affects the cAMP-dependent protein kinase A pathway to inhibit the cell growth through inhibition of Wnt/β-catenin pathway, which often over-activation in lung cancer. More cell biology and protein functional analyses will help us to gain insights of molecular mechanisms for the anti-cancer effects of OSU03013.

參、緒論

一、研究背景

1. 肺癌治療現況

癌症一直是我國國人十大死因之首位，根據衛生署公佈之數 據，民國九十四年，癌症死亡原因依序為：肺癌、肝癌、結腸直腸癌、

女性乳癌、胃癌、口腔癌（含口咽及下咽）、攝護腺癌、子宮頸癌、

食道癌、胰臟癌；在過去十年間，肺癌在國人癌症死亡率的排名一直 居高不下，且死亡率及發生率不斷逐年攀升，近兩年甚至已經是癌症 死亡率排名的第一位 [Department of Health]。近年來儘管於治療不同 形式的肺癌患者時，在外科手術、放射線治療和化學治療已有所改 善，但仍無法克服肺癌的高復發率、高轉移率及抗藥性問題。肺癌病 人在早期不易偵測，發現時都已經是中後期了，而晚期的肺癌病人治 療是以化療為主，但是大多數病人對傳統化療藥物有著很高的抗藥 性，而且病人常常身受這些化療藥物的副作用所苦，所以當務之急是 積極開發肺癌的新藥以治療肺癌病人。

2. 新穎抗癌藥物 OSU03013

本實驗室經由合作研究關係，與美國俄亥俄州立大學 Prof.

Ching-Shih Chen （陳慶士博士）取得一名稱為 OSU03013 的新穎抗

癌藥物，它為 celecoxib 的結構修飾物 (Fig 1) [Zhu et al., 2002;

2004]。Celecoxib 在過去常被拿來當作關節炎的治療藥物，最近有研

究報導 celecoxib 在 HeLa cell 會經由抑制 cyclooxygenase-2 (COX-2) 的信息傳遞路線而引發細胞凋亡 (apoptosis) 現象的發生 [Fukada et

al., 2007]。

Celecoxib 的結構修飾藥物 OSU03013 在 Dr. Chen 的實驗中，針 對攝護腺癌有很強的腫瘤抑制效果；在攝護腺癌細胞實驗中 (in vitro test)，OSU03013 會藉由 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1)/AKT 訊息傳遞路徑有效的降低 AKT 磷酸化的現象，使原本

不易死亡的攝護腺癌細胞死亡率提升，並且加強了細胞 apoptosis 的 情形發生 [Song et al., 2002; Zhu et al., 2002; 2004]。AKT 的一個主要

功 能 是 在 生 長 因 子 調 控 下 被 磷 酸 化 而 促 進 細 胞 生 長 及 抑 制 apoptosis，而造成細胞癌化 [Scheid and Woodgett, 2001; Testa and Bellacosa, 2001]；而 AKT 在乳癌以及攝護腺癌有過度磷酸化的情形，

因此 OSU03013 藉由 AKT 活性抑制的確可以解釋其抑制攝護腺癌生 長的情形。

OSU03013 能 有 效 的 抑 制 攝 護 腺 癌 細 胞 生 長 並 增 加 癌 細 胞 apoptosis；除了攝護腺癌之外，OSU03013 在乳癌的研究也發現它對 人類上皮生長因子接受器 (human epidermal growth factor receptor/

HER-2) 高表達的乳癌細胞有很高的細胞毒殺效果 [Kucab et al., 2005; Zhu et al., 2004]。至於在肺癌的研究中，Tong 等人 [2006] 在 A549 肺癌細胞處理 OSU03013 於 10μM 時，會經由粒線體調控機制 誘導細胞凋亡，但此現象與AKT 調控路徑的抑制無關。

3. 細胞 apoptosis 的分子機制

根據先前的研究發現 OSU03013 會引發細胞凋亡 [Tong et al., 2006]，在細胞凋亡的過程中，細胞會出現一些特有的現象，包含了

細胞膜的不對稱萎縮、DNA 的 200bp 片斷化、細胞核濃縮 [Savill et al., 2002]。在免疫系統的機制中，進行細胞凋亡的細胞為了被吞噬細胞

辨識，細胞會把在細胞膜內層的 phosphatidylserine (PS) 翻到外層被 吞噬細胞辨識 [Hirt and Leist, 2003; Munoz et al., 2007]，最近的研究

報 導 亦 指 出 細 胞 凋 亡 會 有 PS 外 翻 的 現 象 [Fadok et al., 2001;

Hoffmann et al., 2001]，所以 PS 外翻可以成為一個早期細胞凋亡的指 標。

目前已知誘發細胞凋亡的作用途徑主要有三大類，包含透過活化 細胞膜上的死亡受體的外在路徑 (death receptor pathway)、藉由粒線

體 調 控 的 內 在 路 徑 (mitochondrial pathway) [Remillard and Yuan, 2004] ， 以 及 誘 發 內 質 網 氧 化 壓 力 效 應 所 調 控 的 內 質 網 路 徑 (endoplasmic reticulum pathway) (Fig 2A) [Mehmet, 2000; Nakagawa et

al., 2000]。

當持續或是有大量的內質網壓力效應 (endoplasmic reticulum, ER stress) 將會驅使細胞凋亡的發生 [Boyce and Yuan, 2006]；在內質

網壓力效應的過程中，引發了ER transmembrance protein, PRKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) 的磷酸化，被活化的 PERK 會進

而磷酸化eukaryotic translational initiation factor-2α (eIF2α)；磷酸化的 eIF2α (phospho-eIF2α) 會 使 apoptosis-associated protein GADD34 (GADD34) 的蛋白表現上升，而過度表現的 GADD34 則會導致細胞 凋亡的發生 (Fig 2B) [Boyce et al., 2005; Kojima et al., 2003; Novoa et

al., 2003]。再者，內質網壓力效應也會使不活化態的 pro-caspase 12、

pro-caspase 4 形成活化態 caspase 12、caspase 4 進而引發細胞凋亡 [Ferri and Kroemer, 2001, Nakagawa et al., 2000; Rao et al., 2004]。

4. 藥物標的蛋白的研究

4.1. 蛋白質體學的簡介

蛋白質體學 (proteomics) 是研究生物的蛋白質體 (proteome)，也 就是由生物細胞及組織所製造所有的蛋白質組合。“proteome”一詞由 Wilkin 等人在 1994 年首度提出，是仿照基因質體 (genome)，來代表 所有基因質體所表現或有關聯的蛋白質[Wasinger et al., 1995]。蛋白

質體研究是分子生物學上另一個新的紀元，其所分析的重點可分成：

（1）鑑定出某特定細胞、組織或生物體所製造的所有蛋白質；（2）

訂出這些蛋白質如何交互作用，形成類似電子線路圖的網路連結；以 及（3）描繪出各個確實的三級結構，以便找出其中活化位置，也就 是可以讓藥物作用，造成蛋白質功能開啟或關閉的位置。蛋白質不同 於基因屬於線性結構，它可折疊成難以預估的形狀。再加上細胞經常 還會在蛋白質上添加醣類、脂質或是兩者都有，而加以修飾，使得結 構更難以預測，所以蛋白質體學比基因體學更加重要。

4.2. 蛋白質體學的研究

蛋白質體學是可以大量分析蛋白質的分析方法，由二維電泳凝膠 (Two dimensional gel electrophoresis) [O’Farrel, 1975] 的蛋白質點的 鑑定到蛋白質-蛋白質相互作用的特性描述。蛋白質體學有系統性的 鑑定細胞或組織中所有的蛋白質表現，而且，可以用以測定每一個蛋 白質的特性如：蛋白質的量及修飾的情形。該項技術結合蛋白質及胜 肽的分離、分析物質之鑑定及定量、以及資料的整合與分析。一般蛋 白質體學的操作技術分為：（1）二維凝膠電泳法（two-dimensional gel electrophoresis）；（2）蛋白質顯色；（3）影像分析；（4）質譜分析 （mass spectrometry, MS）；（5）資料庫比對 [Wilikins and Gooley, 1997]。以 下針對此操作技術加以簡單介紹：

（1）二維凝膠電泳法

二維凝膠電泳為結合了 IEF (isoelectric focusing) 和 SDS-PAGE (Sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 的蛋白質 分離技術 [Bjellqvist et al., 1982]。在第一維等電點焦集電泳 (IEF) 主 要是利用蛋白質等電點 pI 差異，在 IEF 中，蛋白質正電荷密度高，

則遷移集中至pH 較高的位置，反之，蛋白質負電荷密度高，則遷移 集中至pH 較低的位置。第二維電泳則使用 SDS-PAGE（單一或梯度 濃度），SDS-PAGE 原理是利用蛋白質的分子量大小來分離蛋白質。

（2）蛋白質顯色

二維電泳膠片的顯色上，一般都在二維凝膠電泳階段後進行，常 見的染劑有silver stain colloidal、coomassie blue 及 SYPRO Ruby 螢光 染劑 [Merril et al., 1979]。

（3）影像分析

在二維凝膠電泳結束後所得到的蛋白質點狀分佈圖後，再將表現 有顯著差異性的點做質譜分析。目前有幾個影像比對分析軟體，如 PDQuest (BioRad)、ImageMaster (Amersham Biosciences)，藉由影像 比對分析軟體使用，將雜點過濾、點的比對、3-D 圖為輔助工具判斷 每點的表現量，再以統計方式做蛋白質點表現差異性的數據呈現，相

（4）質譜分析

蛋白質體學為一系統性的分析細胞或組織中蛋白質表現情形的 科學，而其中質譜是一個必要的分析工具。質譜法是根據蛋白質的組 成原子所帶有的質量，利用磁場或電場加以分離，實驗結果呈現在圖 上是一個個的訊號峰值 [Haynes et al., 1998]。目前常使用於蛋白質體 的質譜技術可以分為兩類：單一質譜 (single stage mass spectrometer) 和tandem MS-based system。單一質譜；常見的如 Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) [Patterson and Aebersold, 1995]，它可用於胜肽質量定位技術 (peptide mass mapping technique) 以大量鑑定蛋白質；tandem MS-based systems 有 triple quadrupole﹐ion-trap 及最近常見的 Quadrupole-TOF (Q-TOF) [Keough

et al., 1999; Link et al., 1999; Swiderek et al., 1998]。就蛋白質體的研究

而言，Q-TOF 的分析是比較佳的選擇，因為可以直接得到胺基酸序 列的資訊，但在實際操作上卻有很多的難題，如樣品精製、流速、液 滴化的條件或大量的樣品等。與Q-TOF 比較，MALDI-TOF 的分析是 具有分析較快速且樣品製備較為簡易等優點，故一般以MALDI-TOF 作為研究蛋白質體研究的初步質譜分析，較為快速且經濟 [Loo et al., 1999]。

（5）資料庫比對

在蛋白質體學的研究上，資料庫比對是關鍵性的步驟，因蛋白質 體學現今的發展是以實驗所得到的數據比對已開放資料庫中的資 料，目前網路上有許多資料庫比對網站提供免費的比對軟體，如：

Protein prospector、Mascot 或 ExPASy-PeptIdent 等，而引用的資料庫

以NCBI (National Center for Biotechnology Information) 及 Swissprot 為主。NCBI 是根據 DNA 來推算蛋白質的資料庫，Swissprot 則主要

是根據蛋白質為主的資料庫，此二者資料庫皆可提供胜肽序列資料庫 和核苷酸序列 [ExPASy Molecular Biology Server]。而比對到的蛋白 質可再以另一個比對軟體或換成另一資料庫進行交叉比對或將所得 到的蛋白質資訊輸入蛋白質資料庫中則可得知蛋白質的進一步資 訊，例如發表文獻、功能或其來源，如此可確定所比對到的蛋白質的 可信度 [Wilkins, et al., 1998]。

二、研究目的

本研究為了解OSU03013 藥物處理肺癌細胞內的分子機制，首先 以細胞學檢測法如：利用cell counting 來檢測藥物的細胞毒殺性，利 用 流 式 細 胞 儀 (flow cytometry) 來 分 析 細 胞 週 期 ， 利 用 phosphatidylserine (PS)染色及螢光顯微鏡觀察早期細胞凋亡的現象。

並利用蛋白質體學的方法來了解細胞內蛋白體在 OSU03013 藥物處 理後的表現差異，進一步將蛋白質體學鑑定出之藥物處理表現差異蛋 白以西方點墨點法確認；並針對已知與藥物處理所導致之 apoptosis 可能路徑及蛋白加以確認，期望能瞭解新穎藥物OSU03013 是否有潛 力作為肺癌之抗癌藥物及其分子機轉。研究日地列述於下：

1. OSU03013 處理肺癌細胞株，探討其對肺癌細胞株及肺正常細胞的 毒殺作用。

2. 探討 OSU03013 處理肺癌細胞株之後 apoptosis 的現象，包含 PS 的染色，內質網壓力效應。

3. OSU03013 在處理肺癌細胞實驗中，本研究希望能找到其藥物在各 種apoptosis 相關之訊息傳導路徑的目標蛋白質 (target proteins)。

4. 結合蛋白質體學的方法，偵測新穎抗癌藥物 OSU03013 之影響蛋 白 (effector proteins)，並利用西方點墨法去確認這些影響蛋白質，

藉以探討OSU03013 對肺癌細胞株的細胞凋亡影響及其分子機制。

肆、研究材料與方法

一、研究材料

1. 肺癌細胞株

三株肺癌細胞 (細胞名稱、培養基、細胞型態；見下表)，皆 是對肺癌傳統化療藥物cisplatin 具有很高抗藥性的肺癌細胞株；

將細胞培養在37℃，5% CO2培養箱中；培養基 (GIBCO, Grand Island, N.Y.) 包含 10% fetal bovine serum (BIOCHROM AG, Leonorenstr, Berlin)，1%抗生素 (penicillin-streptomycin; GIBCO)。

DMEM，Dulbecco's Modified Eagle's Medium。

RPMI，Rosewell Park Memorial Institute。

2. Celecoxib 的結構修飾物 OSU03013

OSU03013，由美國俄亥俄州立大學 Dr. Ching-Shih Chen (陳慶 士博士) 所提供；其結構列於 Fig. 1。

Cell Name

Medium Characteristic Source

A549 DMEM adenocarcinoma American lung cancer patient CL1-1 DMEM adenocarcinoma Taiwanese lung cancer patient H1435 RPMI1640 adenocarcinoma American lung cancer patient

二、研究方法

1. 細胞培養

將細胞以其專用培養基培養於37℃、5% CO2 培養箱中；細胞株 以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer) 時，即可進行 繼代培養 (subculture)。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸 去上層液，再以5 ml phosphate-buffered saline (PBS) 洗細胞兩次，吸 去 PBS 並加 1 倍 trypsin-EDTA 1ml，前後左右搖晃培養皿使 trypsin 均勻分散於細胞層，並置於培養箱中約2~3 分鐘後，搖晃培養皿同時 以倒立式顯微鏡觀察，待細胞層脫落並浮起時，取適當比例的細胞於 新的培養基中 (total value 10ml)，以十字型搖散細胞，培養在 37℃，

5% CO2 培養箱中；約 2-3 天細胞株長滿，即可再行繼代培養。

2. 藥物處理之細胞毒性分析 (Cytotoxicity Assay)

取細胞 (約 1x10⁵個) 於 60mm 的培養皿培養 12~16hr。隔天分

別 將 不 同 濃 度 之 OSU03013 處 理 肺 癌 細 胞 株 48 小 時 ， 經 過 trypsin-EDTA 處理使細胞自培養皿上脫落，並利用 trypan blue (0.4%) (SIGMA, ST. Louis, MO) 將死亡細胞染色，於顯微鏡下計數細胞量，

可得知細胞經藥物處理後，藥物是否對於細胞具有毒殺作用。

3. 細胞週期分析 (利用 Flow cytometry, 流式細胞儀)

細 胞 於 不 同 細 胞 週 期 時 ， 具 有 不 同的 核 酸 含 量 變 化 ， 利 用 Propidium Iodide (PI, from Sigma) 嵌插入核酸分子，並利用 Flow cytometry 偵測 PI 所發出之螢光量，來代表樣品中核酸分子含量的多 寡。首先將不同肺癌細胞株A549、CL1-1、H1435 個別處理 IC50 濃 度之OSU03013，並依照 24 小時或 48 小時不同時間點收取細胞，經 過 PBS 潤洗二次，並於 80%酒精於-20℃固定細胞 over-night 後再以 PBS 潤洗細胞完全去除酒精，加入 2μg/ml PI、1μg/ml RNase A 以及 Triton-X100 於 PBS 混合液，於 37℃避光反應 30 分鐘，反應結束後

以Flow cytometry 偵測各不同時濃度、不同時間點之不同細胞的細胞 週期變化。

4. phosphatidylserine (PS) 染色以偵測早期細胞凋亡

2x10⁵個細胞，利用60mm 的 culture dish 培養。分別處理 DMSO

及IC50 濃度的 OSU03013，經過 24 小時後，使用 Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (GIBCO) 清洗三次，加入 anti-phosphatidylserine (PS) 一級抗體 (UPSTATE, Lake Placid, NY)，在室溫下經過一個小時的反 應時間，再使用 HBSS 清洗兩次，加入接有螢光分子的二級抗體 (CHEMICON, Temecula, CA) 室溫反應一小時後，再以 HBSS 潤洗兩

次。最後以螢光顯微鏡 (Olympus BX50 fluorescence microscope;

Dulles, VA) 觀察細胞染色結果。

5. 細胞株蛋白質萃取

將細胞收集，以PBS 洗過三次，1000 rpm 離心 5 分鐘，除去上 清液後，於冷凍乾燥機抽乾2~16 小時，保存於-80℃。於冰上將細胞 加入C-lysis solution (7 M urea, 4% CHAPS, 2 M thiourea, 0.002%

bromophenol blue) 萃取蛋白質，以超音波震盪 5 分鐘後 (10sec on/off) 離心(12000rpm, 30 min)，取含有蛋白質的上清液，保存於-80℃冰箱 中以避免蛋白質降解。

6. 蛋白質定量

採用Bio-Rad Protein Assay 之方法，取 1μl sample 溶液至 96 well 培養盤中，加入400μl ddH2O，然後再加入 100μl dye 混合作用，以 595nm 測吸光值 (ELISA reader)。並以 0、1、2、5、10、15、20、25 mg/ml 的牛血清蛋白 (bovine serum albumin standard) 作為標準蛋白 求出標準曲線，回歸後求出直線方程式，換算樣品中蛋白質濃度 (mg/ml)。

7. 蛋白質體學：

7.1 一維等電點電泳凝膠 (Isoelectric focusing, IEF)

取500μg 蛋白質溶於 C-lysis solution (7 M urea, 4% CHAPS, 2 M thiourea, 0.002% bromophenol blue, 65 mM DTE, 0.5% IPG Buffer)，共 350μl 體積的樣品，使用線性、非線性 pH 3-10 的 strip 或線性 pH 4-7 的 strip 於 IPGphor™以電壓 50V，復水 (rehydration) 12 小時；之後 的program 為:

Step1: 100V 100 vhr Step2 : 250V 250 vhr Step3 : 500V 500vhr Step4 : 1000V 1000vhr Step5 : 3000V 3000vhr Step6 : 8000V 60000vhr total 65kvhr 7.2 平衡 (Equilibrium)

一維等電點電泳結束後將strip 放入 plate 中進行平衡的步驟，以 2% DTE (1,4 Dithioerythritol) 浸泡 15 分鐘，再將 DTE 吸除，換 2.5%

IAA (Iodoacetamide) 浸泡 15 分鐘。

7.3 梯度膠體電泳 (Gradient SDS-PAGE)與分析

將上述之等電聚焦的蛋白質strip 以 12%的 SDS-PAGE 膠片依分子 量進行第二維分離。將跑完之膠片以 7% acetic acid 和 10% methanol

之固定液 (fixation solution) 浸泡 30 分鐘。之後吸乾固定液，以 ddH2O

清洗一次。以 SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain(Bio-Rad)進行染色 (需要 避光) 3~16 小時。回收染劑，以 7% acetic acid 和 10% methanol 的溶液

來脫色。吸乾脫色溶液。將膠放在4℃ddH2O 中保存。之後以 Typhoon 9200^TM (Amersham Biosciences)掃膠以及 Image Master^TM (Amersham Biosciences)進行蛋白質表現差異分析。

7.4 膠體內水解 (In-gel digestion)

先使用事先以甲醇洗淨的 tip 將表現具差異的蛋白質點挖下，以 及無蛋白質點之膠體做為negative control，把膠體置入用甲醇洗淨的 0.5μl 的 eppendorf 內。

利用 Na2CO3退染 SYPRO-Ruby^TM，再以 NH4HCO3/ACN 振動清 洗膠粒 15 分鐘，去除所有液體後加入適量 ACN 使膠體驟縮成白色。

去除ACN 後加入 NH4HCO3使膠體復水，五分鐘後加入等量的ACN，

重複此步驟三次，待膠體變白縮小後馬上去除 ACN，並置入真空離心 機中離心10 分鐘，使膠體乾燥。

將還原溶液(25 mM NH4HCO3 + 10 mM DTT)加入離心抽乾的膠 體中靜置在56℃之下 45 分鐘，待冷卻至室溫後加入烷基化溶液(25 mM NH4HCO3 and 55 mM iodoacetamide)，避光置於室溫下 30 分鐘，去除

所有溶液後以NH4HCO3 / ACN 振動清洗膠粒 15 分鐘兩次，加入適量 ACN 使膠體驟縮成白色後真空離心 10 分鐘。

膠體在以真空離心機抽乾後，加入trypsin (25 mM NH4HCO3 with 5 ng/μl of trypsin) 溶液置於 37℃作用 8 小時，進行膠體內水解。

將經過trypsin 反應過的樣品先離心，加入用 100% ACN/2% TFA 配置萃取液 20μl。超音波震盪 10 分鐘，取出上清液，放入新的 eppendorf。再加入 50% ACN / 1% TFA 的萃取液 20 μl。超音波震盪 10

分鐘，取出上清液，放入同樣的eppendorf。將所得之樣品進行質譜分 析。

7.5 質譜分析蛋白質身分

將 分 析 物 樣 品 與 基 質 溶 液 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA) 混合均勻，點於樣品探針 (sample target) 上，在室溫下以自 然乾燥方式使分析物與基質形成結晶，再送入MALDI-Q-TOF 中分析。

將上一步驟所得之純化蛋白質以 MALDI-Q-TOF 進行質譜分析，

並且針對資料庫 NCBI 和 Swiss-Prot 採用免費軟體 Mascot (http://

www.matrixscience.com/) 進行 MS 及 MS/MS 比對搜尋，進行蛋白質身 分鑑定分析，鑑定出蛋白質身分。

8. 西方點墨法 (Western blot)：

8.1 電泳轉漬

取 20~30μg 蛋白質加入樣品緩衝液 (3X sample buffer，包括 350mM Tris-HCl pH6.8, 12% SDS, 0.02% bromophenol blue, 35%

glycero1, 30% mercaptoethnol) 煮沸 5 分鐘後，以 SDS-PAGE (4%

stacking gel 及 10% 或 15% resolving gel) 先以電壓 80 伏特進行 30 分 鐘後，將電壓調至160 伏特再進行電泳 70 分鐘。

8.2 免疫呈色

將SDS-PAGE 上的蛋白質先以 150V，1.5 小時的條件轉漬到 100%

MeOH 浸潤過的 PVDF (polyvinylidene difluoride) 膜上(Millipore, Bedford, MA)，之後將膜取出並浸泡於 blocking solution (10% skim milk in PBS-T)，室溫下作用 1 小時後，以 PBS-T (phosphate-based saline-0.5% Tween-20) 清洗 3 次，每次 5 分鐘。分別加入一級抗體 (見 下表)，在 4℃，16 小時後，以 PBS-T 清洗 3 次，每次 5 分鐘，並加 入二級抗體，於室溫下作用1 小時後，再以 PBS-T 清洗 3 次，每次 5 分鐘。最後用 ECL Chemiluminescent Western System (Amersham, Arlington Height, IL, USA) 試劑組加在膜上，在暗房以 X 光底片壓片 顯影或用影像系統顯影。

抗體名稱 稀釋比例 產品公司 產品編號#

Annexin A3 1:1000 Abcam Ab30988 α-Tubulin 1:1000 Upstate 05-829 β-Actin 1:5000 Abcam Ab6276 β-Catenin 1:500 BD 610153 Caspase 12 1:1000 Cell signaling 2202 CDC2 1:1000 Cell signaling 9112 p-CDC2 1:1000 Cell signaling 9111 p-eIF2α 1:1000 Biosource 44-728 GADD34 1:1000 Novus NB100-778 GSK3β 1:1000 Abcam Ab9769 Hsp27 1:1000 Chemicon Ab3489 Hsp70 1:1000 Novus NB600-1165

Hsp90 1:200 Abcam Ab1429

p-PERK 1:1000 Cell signaling 3179 PKA 1:1000 Novus NSB988

9. 模擬分子對接 (molecular docking)

將OSU03013 當 ligand，PKA 蛋白當作 target，對於已知的 ATP binding site 使用生物資訊軟體 Autodock 作 docking 模擬實驗，先定義 出target protein binding site；再旋轉 ligand 的鍵角，產生新的構形。

根據Ligand 與 target protein binding site 的形狀比對，以及 ligand 方向 的變更，計算何種構形可以被計分。此計分方法是以 DockScore 軟 體，計算該構形的內能，以及該構形與目標蛋白質之間的能量(包括 凡得瓦力及靜電力) 決定出 Ligand 與 target protein binding site 最有可 能的結合方式與參與之胺基酸。

伍、結果

1. 藥物 OSU03013 處理肺癌細胞株 A549、CL1-1 及 H1435 的細胞形態

在光學顯微鏡下，正常的肺癌細胞 A549、CL1-1 及 H1435 其細 胞形態是貼住培養基盤底的，當細胞死亡時，細胞的型態或碎片會懸 浮在培養基中。在藥物OSU03013 的影響下，三種模式細胞皆可觀察 到有明顯死亡的現象 (Fig 3)。

2. 利用藥物 OSU03013 處理正常肺細胞株 MRC5 及肺癌細胞株 A549、CL1-1 及 H1435 並探討其藥物毒殺性

利用 Trypan Blue 染色法對細胞進行細胞計數，測量藥物 OSU03013 對肺正常細胞 MRC5 及肺癌細胞 A549、CL1-1、H1435 的 細胞毒殺性。處理 OSU03013 經 48 小時之後，測得 IC50 的濃度分 別為A549 (1.53μM)，CL1-1 (1.93μM)，H1435 (3.50μM)，這些劑量對 於肺正常細胞MRC5 並無明顯的毒殺作用 (Fig 4)。

3. OSU03013 導致細胞週期在間期一停滯 (Gap 1, G1 arrest) 及早期 的細胞凋亡 (early apoptosis)

從藥物 OSU03013 對模式細胞的細胞毒殺實驗可發現，處理藥 物後的細胞有凋亡 (apoptosis) 及壞疽 (necrosis) 的現象。因此我們

利 用 細 胞 流 式 儀 來 探 討 OSU03013 影 響 細 胞 死 亡 的 機 制 。 在 OSU03013 處理細胞 0、24、48 小時之後，我們發現細胞週期 G1 期

的細胞數目有隨著處理藥物後的時間延長而增加，三種模式細胞 A549、CL1-1 及 H1435 在處理藥物 48 小時其 G1 時期細胞數目分別

為83.5%、70.3% 以及 87.4% (Fig 5A)。

除此之外，細胞分裂期 (M phase) 標記蛋白 p-CDC2 在藥物處 理模式細胞後也有磷酸化表現量上升的趨勢 (Fig 5B)，有研究指出在 CDC2 的胺基酸序列 Tyr 15 位置磷酸化，CDC2 活性會被抑制，導致 細胞週期停滯在G1 期而無法進行細胞分裂 M 時期，此結果與本研究 在 流 式 細 胞 儀 所 偵 測 到 的 G1 arrest 現象相吻合 [Hunter, 1995;

Watanabe et al., 1995]。

本研究亦以早期細胞凋亡標記 (phosphotidylserine, PS) 外染的 技術來偵測細胞凋亡的鑑別。PS 位於細胞膜內側，當細胞被引發細

胞凋亡時，因為細胞膜會外翻，因此 PS 會在細胞表面被偵測到 [Williamson and Schlegel, 2004]。處理藥物 OSU03013 後，三種模式

細胞的 PS 染色，利用螢光顯微鏡皆可看見明顯的 PS 抗體染上處理 藥物後的細胞膜 (Fig 5C)。

4. 肺癌細胞株 A549、H1435、CL1-1 處理 OSU03013 引發內質網壓 力效應（endoplasmic reticulum, ER stress）

當細胞遭受持續或是有大量的內質網壓力效應時，亦會驅使細 胞凋亡的發生。在內質網壓力所引發的細胞凋亡過程中PERK、eIF2α 的磷酸化，及其下游蛋白GADD34 活化，其蛋白質表現量皆會增加，

再者，內質網壓力效應也會藉由活化caspase 12 而引發細胞凋亡。本 研究三種模式細胞在處理OSU03013 後，這些會因內質網壓力而引發 細胞凋亡相關的蛋白質，phosopho-PERK、phosopho-eIF2α、GADD34 的表現量皆有不同程度的上升，而caspase 12 也在藥物處理後也有從 不活化態被切成活化態的情形 (Fig 6)。

5. 利用蛋白質體學方法來尋找藥物處理細胞後的目標及影響蛋白

我們透過蛋白質體學的方法來探討 OSU03013 藥物對肺癌細胞 CL1-1、H1435 所產生的蛋白質體表現之影響。分別將 CL1-1、H1435 細胞株以pH 3～10 非線性 non-linear (NL)、pH 3～10 及 pH 4～7 線 性膠條進行一維及之後的二維電泳來做初步篩選。電泳分析結果將蛋 白質完全依造它們的等電點及分子量不同而分離，膠體上的每一個點 代表一個蛋白質，之後會對這些點進行蛋白質與鑑定。此實驗的目的 在分析肺癌細胞株處理藥物前後的蛋白質表現差異，藥物處理後肺癌 細胞表現量高的蛋白我們定義為藥物處理後被 OSU03013 所誘導的 蛋白，藥物處理後表現量低的蛋白我們定義為肺癌細胞被 OSU03013

所抑制的蛋白。(Fig 7A) 以 500μg 之萃取蛋白為二維電泳分析，使用 SyproRubyb 染色，利用 ImageMaster 軟體分析，我們可以看出藥物處

理前後表現量有差異的蛋白質點，再將這些表現差異大於兩倍的蛋白 質點做膠體水解 (in-gel digestion)，利用 trypsin 水解後的蛋白質進行 質譜分析，利用 MALDI-Q-TOF 所得到的分析結果，透過 Mascot 網 站做蛋白質的鑑定，一共鑑定了204 個蛋白質點，保留了比對後可信 度高的蛋白及去除角蛋白 (keratin) 後 (因 keratin 蛋白多為二維電泳 常見之非專一性蛋白)，整理成表 (Table 1 and Table 2)，這些蛋白包

含了cAMP protein kinase inhibitor β (PKIB, 激酶抑制蛋白)、數種 G proteins (G 蛋白)、數種 Heat-shock proteins (熱休克蛋白)、Antioxidant enzymes (去氧化蛋白)、及其他調控細胞生長、代謝的蛋白質。之後 以西方點墨法來更加確認蛋白質鑑定的精準度 (Table 3)。一些 OSU03013 處理 48 小時後表現量會下降的蛋白如：Annexin A3、

α-tubulin、HSP27、HSP70、HSP90，在西方點墨法的實驗結果與蛋 白質體學鑑定的結果一致 (Fig 7B)。

6. 藥物 OSU03013 與 PKA 的分子對接 (Molecular Docking)

研究發現PKA 是調控細胞增殖一個很重要的蛋白 [Masai et al., 2005]，而在我們利用蛋白質體學的方法去尋找藥物 OSU03013 在肺

癌細胞的目標蛋白質結果中，因為PKIB 的過度活化 (Table 2)，我們 預測其下游蛋白cAMP-dependent protein kinase (PKA) 的蛋白表現量 在處理藥物後會下降，之後透過 Glycogen synthase kinase-3 beta (GSK3β) 的調控路徑去調控 β-catenin，使得身為轉錄協同因子的 β-catenin 蛋白表現下降。利用西方點墨法，本研究證實了 PKA 的蛋

白表現的確下降，進而影響 GSK3β之磷酸化下降，而導致 β-catenin 蛋白的表現下降 (Fig 8A)。而在 OSU03013 與 PKA 蛋白質結構之分 子對接 (Molecular Docking) 的電腦模擬中發現，OSU03013 可以穩 定的對接在PKA 的 ATP binding site 上 (Fig 8B)。

陸、討論

肺癌在國人癌症死亡率一直都是居高不下的，歸咎其原因不外 乎是其癌症本身的高轉移率以及對傳統化療藥物的高抗藥性，所以近 年來新藥的開發一直是癌症研究中一個很重要的課題。OSU03013 是 celecoxib 的結構修飾物，celecoxib 長久以來一直被用來治療關節炎，

它為 COX-2 的抑制劑 [Zhu et al., 2002]；在近年來的研究中發現 OSU03013 對於攝護腺癌及乳癌有抑制的效果 [Song et al., 2002]。本 研究以細胞模式證明了 OSU03013 亦可針對肺癌細胞透過內質網壓 力效應，引發細胞凋亡，並且為第一篇以蛋白質體學的方法去偵測 OSU03013 對於肺癌細胞的目標蛋白，並針對藥物的目標蛋白探討其 分子機制。

對於肺正常細胞而言，OSU03013 並不會造成細胞的毒殺作用，

但 是 對 於 癌 細 胞 ，OSU03013 的 毒 殺 作 用 比 傳 統 癌 症 治 療 藥 物 cisplatin 有更好的效果，cisplatin 的 IC50 在各種肺癌細胞分別為：A549 (6.35μM)、CL1-1 (8.76μM)、H1435 (21.78μM)，相較於 OSU03013 的 IC50 遠低於 cisplatin，特別是 A549 (1.53μM) 及 CL1-1(1.93μM) 這 兩株肺癌細胞，其 IC50 甚至低於 2μM，所以，OSU03013 在肺癌的 治療藥物中，是一種非常有潛力的藥物。

在模式細胞處理藥物 OSU03013 之後，細胞週期蛋白 Cell division cycle 2 (CDC2) 胺基酸序列 Tyr 15 位置被磷酸化的現象增

加，因此CDC2 的活性會被抑制，導致細胞無法從 G2/M 的細胞週期 關卡 (checkpoint) 進入細胞分裂期；另外，利用流式細胞儀實驗結果 發現，在 G1 時期的細胞隨著藥物處理後的時間增加而細胞比例增 加，顯示細胞在處理藥物後細胞週期停滯在G1 時期（相對的細胞分 裂期也較少），結果顯示 OSU03013 除了會造成細胞的毒殺作用以 外，它亦會造成肺癌細胞的生長遲滯。

細胞的死亡不外乎細胞凋亡 (apoptosis) 及細胞壞疽 (necrosis) 的現象；本研究發現，OSU03013 處理細胞後利用 PS 的染色技術觀 察到細胞膜的外翻現象，此一現象為早期apoptosis 的現象。

目前已知誘發細胞凋亡的作用途徑主要有三大類，包含透過活 化細胞膜上的死亡受體的外在路徑、藉由粒線體調控的內在路徑，以 及誘發內質網氧化壓力效應所調控的內質網路徑 [Nakagawa et al., 2000; Remillard and Yuan, 2004]。在本研究中發現，Caspase 12 在藥

物處理細胞後有從不活化態轉變成活化態的情形，而Caspase 12 為內 質網壓力效應一個重要的指標。Nakagawa 等人發現 caspase 12 會和 78-kDa glucose- regulated protein (grp78)、presenilin-2 及 β-amyloid

precursor protein (APP) 一同存在於內質網 [Nakagawa et al., 2000]。

經 Nakagawa 等人實驗證實得知 caspase-12 與 APP 被切割形成 Aβ (amyloid-β) 有關聯；然而，有文獻指出 APP 是 caspase-3 專一性的 受質 [Gervais et al., 1999]，故 Nakagawa 等人推測 caspase-3 可能是 caspase 12 下游路徑調控的受質之一，至於是否有 Bcl-2 family 成員 參與其中或 caspase 12 之一般正常生理調控機制皆尚未明確。除了 caspase 12 以外，本研究也利用了 p-PERK、p-eIF2α 以及 GADD34

等內質網路徑相關蛋白，來證明OSU03013 所引發的細胞凋亡現象為 內質網的壓力效應。當內質網受到壓力效應時 PERK 會磷酸化成 p-PERK，進而使下游的 eIF2α 磷酸化成 p-eIF2α 以及 GADD34 表 現上升，造成細胞的凋亡。

為了尋找肺癌細胞受藥物OSU03013 所影響的其他蛋白質，我們使 用蛋白質體學的方法去偵測藥物處理前後的細胞內蛋白質，發現包含了 與細胞分裂、細胞週期有關的 α-tubulin 及 CDC2；熱休克蛋白 (heat shock protein) HSP27、HSP70 及 HSP90；與磷酸化肌醇 (inositol) 代謝 酵素相關的蛋白Annexin A3；與 cAMP-protein kinase (PKA) 訊息傳遞路 徑相關的蛋白cAMP-protein kinase inhibitor (PKIB, 激酶抑制蛋白 B)；及 與 Wnt/β-catenin 調控路經相關蛋白 Glycogen synthase kinase-3 beta

在Dr. Chen 的實驗中，OSU03013 針對攝護腺癌有很大的腫瘤抑 制效果；在攝護腺癌細胞實驗中 OSU03013 抑制 AKT 上游 PDK1，

藥物有效的降低AKT 磷酸化的現象，使原本不易死亡的攝護腺癌細 胞死亡率提升，並且加強了細胞凋亡的情形發生；其在 OSU03013 與AKT 之分子對接實驗結果，也間接的證實了 OSU03013 藥物可以 進入細胞內，進而與細胞質蛋白結合。本研究利用 OSU03013 處理的 肺癌細胞，其PDK1 或是 AKT 的蛋白表現量在西方點墨法實驗中並 無明顯的表現差異 (data not shown)；反而在蛋白質體學實驗中，發 現了 PKIB 為在處理藥物後表現量增加的一個蛋白質點；PKIB 會去 抑制PKA 的表現 [Van Patten et al., 1997]，PKA 信息傳遞路徑為細胞 生長時一個重要的路徑，在西點墨法的實驗中，我們也發現了 PKA 的表現在肺癌細胞處理藥物後有下降的趨勢。另外，在 OSU03013 與 PKA 的分子對接模擬實驗中，本研究預測 OSU03013 會進入細胞 與ATP 分子競爭 PKA 蛋白質上的 ATP binding site，此為 PKA 的活 化區，被 OSU03013 結合的 PKA 其蛋白質活性會下降。在 PKA 蛋白 質表現下降或活性降低的肺癌細胞中，PKA 下游的轉錄因子 cAMP response element binding protein (CREB) 就無法被活化，導致細胞生 長的停滯 (Fig 9)。在過去的研究中 Wnt/β-catenin 調控路徑在肺癌的 病人及細胞是過度活化的，本研究也發現了與 Wnt/β-catenin 有關的

蛋白質 p-GSK3β 在藥物處理後的細胞蛋白表現下降，非磷酸化的 GSK3β 會與 β-catenin 以及 Axin 形成一個複合體，進而使 β-catenin

被分解，導致 β-catenin 的協同轉錄作用不再進行，造成細胞不再生 長 [Mazieres et al., 2005; Masai et al., 2005]。由上述實驗結果我們預 測 OSU03013 在肺癌細胞的作用是使 PKA 在細胞內的表現量或蛋白 活性下降，表現量或活性下降的 PKA 除了影響其下游蛋白 CREB 外，它還讓 β-catenin 無法正常進入細胞核執行轉錄協同作用，最終 導致整個細胞的生長停滯；所以我們預測OSU03013 在低劑量濃度處 理肺癌細胞後，抑制細胞生長的調控路徑為 PKA 調控路徑，非經由 AKT 的調控抑制所致，肺癌細胞經 OSU03013 處理非由 AKT 調控抑 制的現象也在Tong Z 等人 [2006] 的研究中證實。Tong Z 等人的研 究中以 A549 為模式細胞，藥物劑量為 10μM，而細胞死亡的途徑為 cytochrome c 所引發的細胞凋亡。所以在肺癌細胞中，處理 OSU03013 的劑量不同，所影響的細胞生長及死亡的路徑就有可能不相同。

柒、結論與未來工作

一、結論

1. 由於藥物 OSU03013 對肺癌細胞的細胞毒殺作用比一般傳統化療 藥物 (cisplatin) 強，而且對於正常的肺細胞沒有毒殺作用，所以

本研究認為OSU03013 是一個非常值得開發的肺癌新穎抗癌藥物。

2. 在處理低劑量 OSU03013 的三株肺癌細胞會導致細胞週期停滯在 G1 時期，以及因為藥物造成內質網壓力效應 (ER stress) 而有細 胞凋亡 (apoptosis) 的現象。

3. 由蛋白質體學的實驗中，本研究預測 OSU03013 會藉由 PKA 及 Wnt/β-catenin 的這兩條訊息調控路徑去調控細胞，以達到抑制肺 癌細胞生長的效果。

二、未來工作：

1. 藉由肺癌細胞處理 OSU03013 在不同濃度以及處理後不同的時間

點下，探討PKA 活性變化的情形。

2. 在肺癌細胞株中建構一個 PKA 會過度表達的載體，探討在 PKA 蛋白的過度表現下，OSU03013 影響細胞的生長是否有改變。

3. 探討 PKA 下游蛋白質 CREB 及 c-Jun 在藥物 OSO03013 處理後，

蛋白質表現的情形。

4. 利用抑制 PKA 上游 adenylyl cyclase 或 cAMP 的抑制劑來探討 OSU03013 的細胞毒殺作用是否增強。

5. 找尋 PKA 訊息調控路徑的抑制劑，例如 H89 及 KT5720，進而研 究PKA 的抑制劑在肺癌的抑癌效果，及是否有潛力成為新一代的 肺癌治療藥物。

6. 找尋其他被 OSU03013 抑制的蛋白之抑制劑或化合物，進而研究 是否一樣有潛力可以成為新穎抗癌藥。

7. 利用動物實驗持續研究 OSU03013 在肺癌的抗癌效果，觀察在動 物實驗中，OSU03013 是否有與肺癌細胞相同的抑癌效果，進而研 究此藥物對其他臟器的影響以及其生理毒性。

8. 進入臨床試驗，分析及統計 OSU03013 在肺癌病人的治療效果，

評估是否可能成為一個新穎的治療藥物或複合藥物。