4.1. 蛋白質體學的簡介
蛋白質體學 (proteomics) 是研究生物的蛋白質體 (proteome)，也 就是由生物細胞及組織所製造所有的蛋白質組合。“proteome”一詞由 Wilkin 等人在 1994 年首度提出，是仿照基因質體 (genome)，來代表 所有基因質體所表現或有關聯的蛋白質[Wasinger et al., 1995]。蛋白
質體研究是分子生物學上另一個新的紀元，其所分析的重點可分成：
（1）鑑定出某特定細胞、組織或生物體所製造的所有蛋白質；（2）
訂出這些蛋白質如何交互作用，形成類似電子線路圖的網路連結；以 及（3）描繪出各個確實的三級結構，以便找出其中活化位置，也就 是可以讓藥物作用，造成蛋白質功能開啟或關閉的位置。蛋白質不同 於基因屬於線性結構，它可折疊成難以預估的形狀。再加上細胞經常 還會在蛋白質上添加醣類、脂質或是兩者都有，而加以修飾，使得結 構更難以預測，所以蛋白質體學比基因體學更加重要。
4.2. 蛋白質體學的研究
蛋白質體學是可以大量分析蛋白質的分析方法，由二維電泳凝膠 (Two dimensional gel electrophoresis) [O’Farrel, 1975] 的蛋白質點的 鑑定到蛋白質-蛋白質相互作用的特性描述。蛋白質體學有系統性的 鑑定細胞或組織中所有的蛋白質表現，而且，可以用以測定每一個蛋 白質的特性如：蛋白質的量及修飾的情形。該項技術結合蛋白質及胜 肽的分離、分析物質之鑑定及定量、以及資料的整合與分析。一般蛋 白質體學的操作技術分為：（1）二維凝膠電泳法（two-dimensional gel electrophoresis）；（2）蛋白質顯色；（3）影像分析；（4）質譜分析 （mass spectrometry, MS）；（5）資料庫比對 [Wilikins and Gooley, 1997]。以 下針對此操作技術加以簡單介紹：
（1）二維凝膠電泳法
二維凝膠電泳為結合了 IEF (isoelectric focusing) 和 SDS-PAGE (Sodium dedecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 的蛋白質 分離技術 [Bjellqvist et al., 1982]。在第一維等電點焦集電泳 (IEF) 主 要是利用蛋白質等電點 pI 差異，在 IEF 中，蛋白質正電荷密度高，
則遷移集中至pH 較高的位置，反之，蛋白質負電荷密度高，則遷移 集中至pH 較低的位置。第二維電泳則使用 SDS-PAGE（單一或梯度 濃度），SDS-PAGE 原理是利用蛋白質的分子量大小來分離蛋白質。
（2）蛋白質顯色
二維電泳膠片的顯色上，一般都在二維凝膠電泳階段後進行，常 見的染劑有silver stain colloidal、coomassie blue 及 SYPRO Ruby 螢光 染劑 [Merril et al., 1979]。
（3）影像分析
在二維凝膠電泳結束後所得到的蛋白質點狀分佈圖後，再將表現 有顯著差異性的點做質譜分析。目前有幾個影像比對分析軟體，如 PDQuest (BioRad)、ImageMaster (Amersham Biosciences)，藉由影像 比對分析軟體使用，將雜點過濾、點的比對、3-D 圖為輔助工具判斷 每點的表現量，再以統計方式做蛋白質點表現差異性的數據呈現，相
（4）質譜分析
蛋白質體學為一系統性的分析細胞或組織中蛋白質表現情形的 科學，而其中質譜是一個必要的分析工具。質譜法是根據蛋白質的組 成原子所帶有的質量，利用磁場或電場加以分離，實驗結果呈現在圖 上是一個個的訊號峰值 [Haynes et al., 1998]。目前常使用於蛋白質體 的質譜技術可以分為兩類：單一質譜 (single stage mass spectrometer) 和tandem MS-based system。單一質譜；常見的如 Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) [Patterson and Aebersold, 1995]，它可用於胜肽質量定位技術 (peptide mass mapping technique) 以大量鑑定蛋白質；tandem MS-based systems 有 triple quadrupole﹐ion-trap 及最近常見的 Quadrupole-TOF (Q-TOF) [Keough et al., 1999; Link et al., 1999; Swiderek et al., 1998]。就蛋白質體的研究
而言，Q-TOF 的分析是比較佳的選擇，因為可以直接得到胺基酸序 列的資訊，但在實際操作上卻有很多的難題，如樣品精製、流速、液 滴化的條件或大量的樣品等。與Q-TOF 比較，MALDI-TOF 的分析是 具有分析較快速且樣品製備較為簡易等優點，故一般以MALDI-TOF 作為研究蛋白質體研究的初步質譜分析，較為快速且經濟 [Loo et al., 1999]。
（5）資料庫比對
在蛋白質體學的研究上，資料庫比對是關鍵性的步驟，因蛋白質 體學現今的發展是以實驗所得到的數據比對已開放資料庫中的資 料，目前網路上有許多資料庫比對網站提供免費的比對軟體，如：
Protein prospector、Mascot 或 ExPASy-PeptIdent 等，而引用的資料庫
以NCBI (National Center for Biotechnology Information) 及 Swissprot 為主。NCBI 是根據 DNA 來推算蛋白質的資料庫，Swissprot 則主要
是根據蛋白質為主的資料庫，此二者資料庫皆可提供胜肽序列資料庫 和核苷酸序列 [ExPASy Molecular Biology Server]。而比對到的蛋白 質可再以另一個比對軟體或換成另一資料庫進行交叉比對或將所得 到的蛋白質資訊輸入蛋白質資料庫中則可得知蛋白質的進一步資 訊，例如發表文獻、功能或其來源，如此可確定所比對到的蛋白質的 可信度 [Wilkins, et al., 1998]。
二、研究目的
本研究為了解OSU03013 藥物處理肺癌細胞內的分子機制，首先 以細胞學檢測法如：利用cell counting 來檢測藥物的細胞毒殺性，利 用 流 式 細 胞 儀 (flow cytometry) 來 分 析 細 胞 週 期 ， 利 用 phosphatidylserine (PS)染色及螢光顯微鏡觀察早期細胞凋亡的現象。
並利用蛋白質體學的方法來了解細胞內蛋白體在 OSU03013 藥物處 理後的表現差異，進一步將蛋白質體學鑑定出之藥物處理表現差異蛋 白以西方點墨點法確認；並針對已知與藥物處理所導致之 apoptosis 可能路徑及蛋白加以確認，期望能瞭解新穎藥物OSU03013 是否有潛 力作為肺癌之抗癌藥物及其分子機轉。研究日地列述於下：
1. OSU03013 處理肺癌細胞株，探討其對肺癌細胞株及肺正常細胞的 毒殺作用。
2. 探討 OSU03013 處理肺癌細胞株之後 apoptosis 的現象，包含 PS 的染色，內質網壓力效應。
3. OSU03013 在處理肺癌細胞實驗中，本研究希望能找到其藥物在各 種apoptosis 相關之訊息傳導路徑的目標蛋白質 (target proteins)。
4. 結合蛋白質體學的方法，偵測新穎抗癌藥物 OSU03013 之影響蛋 白 (effector proteins)，並利用西方點墨法去確認這些影響蛋白質，
藉以探討OSU03013 對肺癌細胞株的細胞凋亡影響及其分子機制。