模擬臨床移除生物薄膜處理後之細胞貼附定量試驗

Fig. 4-10 為在模擬臨床移除生物薄膜 P.gingivalis 處理後進行螢光顯微鏡下 計數單位釐米平方細胞貼附數量(cell number/mm²)之定量試驗，在 Group 2 中，

在 24、72 及 120 小時的細胞貼附數目為 1.63±1.59、0.75±0.35 及 1.75±0.71，為 此六組中細胞貼附數目最少的組別。在 Group 3 中，重複測試三次後在 24 小時 有 2.12±1.58 的細胞貼附，到 72 小時增加到 29.88±15.73，但到 150 小時候又減 少為 7.13±5.48。而 control 組 Group1 的部分在 24、72 及 120 小時的細胞貼附數 目為 182.88±81.49、507.25±129.05 及 968.63±24.22，在單位釐米平方細胞貼附數 量呈現穩定成長的情形。在 Group 4 中也是三個時間點皆有細胞貼附，重複測試 三次後分別為 178.25±12.37、402.5±86.97 及 739.13±19.27；Group 5 中重複測試 三次後則是 132.75±74.6、404.25±35.71 及 723±44.9；而 Group 6 中重複測試三次 後細胞貼附數目皆比 Group 4 及 5 來的多，三個時間點分別是 160.36±22.80、

544.63±5.83 及 922.75±161.93。

經由統計分析的結果所示，在 24 小時，此六組皆不具有統計上的顯著差異。

在 72 小時，Group 1 與各組相比的結果，與 Group 2(p<0.001)及 Group 3(p<0.001) 具有統計上的顯著差異；Group 2 與各組相比的結果，與 Group 4(p<0.01)，Group 5(p<0.01)及 Group 6(p<0.001)具有統計上的顯著差異；Group 3 與各組相比的結 果，與 Group 4(p<0.01)，Group 5(p<0.01)及 Group 6(p<0.001)也具有統計上的顯 著差異。接下來第三個時間點在 150 小時，Group 1 與各組相比的結果，與 Group 2(p<0.001)及 Group 3(p<0.001)具有統計上的顯著差異；Group 2 與各組相比的結 果，與 Group 4(p<0.001)，Group 5(p<0.001)及 Group 6(p<0.001)具有統計上的顯 著差異；Group 3 與各組相比的結果，與 Group 4(p<0.001)，Group 5(p<0.001)及 Group 6(p<0.001)也具有統計上的顯著差異。其中在 72 小時及 150 小時中，雖然 Group 6 的細胞貼附數量較多，但與 Group 4 及 Group 5 相比，三組則不具有統

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計上的顯著差異，表示藉由鈦金屬刮匙、雷射、合併鈦金屬刮匙及雷射的殺菌處 理方式對於後續 HGF 細胞貼附都有不錯的結果。

Fig. 4- 10 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment from 24 hours to 120 hours.

*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001

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Day 1(24 hours)

Fig. 4- 11 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 24 hours. (a) Group 1 (b) Group 2 (c) Group 3 (d) Group 4 (e) Group 5 (f) Group 6

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

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Day 3(72 hours)

Fig. 4- 12 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 72 hours. (a) Group 1 (b) Group 2 (c) Group 3 (d) Group 4 (e) Group 5 (f) Group 6

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

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Day 5(120 hours)

Fig. 4- 13 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 120 hours. (a) Group 1 (b) Group 2 (c) Group 3 (d) Group 4 (e) Group 5 (f) Group 6

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

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4.4 表面內毒素殘留分析 4.4.1 內毒素動力濁度法

經由鈦板浸泡在不含內毒素的 LAL water 24 小時後，從內毒素動力濁度法 分析後的結果可以看見，Group 1 在 545nm 的吸光值為 0.181±0.001 為此六組中 最少的。而Group 2 有 P. gingivalis 生物薄膜形成的組別為 0.679±0.009，為此五 組中最高的組別。Group 3 有 0.12% CHX 沖洗過後其吸光值有減少為 0.618±0.007，

此與Group 2 具有統計上的顯著差異(p<0.001)。Group 4 經鈦金屬刮匙處理過後 其吸光值為 0.66±0.011 與 Group 2 具有統計上的顯著差異(p<0.05)。Group 5 經 Er:YAG laser 處理過後其吸光值有減少為 0.377±0.004 與 Group 2 具有統計上的 顯著差異(p<0.001)。而 Group 6 經鈦金屬刮匙以及 Er:YAG laser 處理過後其吸光 值有減少為0.395±0.005 與 Group 2 具有統計上的顯著差異(p<0.001)。Group 3 與 各組相比的結果，與 Group 4(p<0.001)，Group 5(p<0.001)及 Group 6(p<0.001)具 有統計上的顯著差異；Group 4 與各組相比的結果，與 Group 5(p<0.001)及 Group 6(p<0.001)具有統計上的顯著差異；Group 5 與各組比較的結果，與 Group 6(p<0.05) 也具有統計上的顯著差異。

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Fig. 4- 14 The residual lipopolysaccharide over titanium discs after various treatments using a UV Spectrum absorbance at 545 nm. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001

Gr.1 Control

Gr.2 P.g

Gr.3 0.12%CHX

Gr.4 Ti curette

Gr.5 Laser

Gr.6 Ti curette + Laser 0.0

0.2 0.4 0.6 0.8

Absorbance (545nm)

Lipopolysaccharide (LPS)

*** *** ****** ***

*** * *** ***

*** *** ***

*** ***

*

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4.5 表面接觸角分析

Fig. 4-15 為經過不同處理後進行接觸角測量之結果。

Fig. 4- 15 Contact angle of P. gingivalis biofilm after different treatment. (a) Group 1 (b) Group 2 (c) Group 3 (d) Group 4 (e) Group 5 (f) Group 6

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

53 (p<0.01)。Group 5 經 Er:YAG laser 處理過後其接觸角有減少為 70.25±6.66 與 Group 1 不具有統計上的顯著差異(p=0.369)。Group 6 經鈦金屬刮匙以及 Er:YAG laser 處理過後接觸角減少為 74.85±9.2 與 Group 1 則不具有統計上的顯著差異 (p=0.631)。

Fig. 4-16 Contact angle of P.gingivalis biofilm after different treatment. *p<0.05

**p<0.01 ***p<0.001

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4.6 表面粗糙度分析

分析 biofilm、chlorhexidine、Ti curette、Laser 及 Ti curette 後施打 Laser 對於鈦板 表面粗糙度之影響。由 Fig. 4-17 可得知這六組的中心線平均粗糙度(Ra)從 Group 1 到 Group 6 的數值分別為 1.37±0.09、1.24±0.25、1.47±0.18、1.35±0.28、1.24±0.25 及 1.29±0.19，各組間並不具有統計上的顯著差異。而平方平均值粗糙度(Rq)從 Group 1 到 Group 6 的數值分別為 1.77±0.13、1.58±0.30、1.89±0.22、1.69±0.30、

1.58±0.06 及 1.65±0.24，各組間也並不具有統計上的顯著差異。而當測得十點平 均粗糙度(Rz)時，從 Group 1 到 Group 6 的數值分別為 9.87±1.10、8.62±1.35、

10.3±1.52、8.41±1.08、8.83±0.41 及 7.77±1.79，其中以 Group 4 經鈦金屬刮匙處 理後及 Group 6 經鈦金屬刮匙及 Er :YAG laser 處理後這兩組，經統計分析後與 Group 1 的 control 組相比則是具有統計上的顯著差異(p<0.05)

Fig. 4-17 Surface roughness analysis of Ra Rq and Rz of P. gingivalis inoculation on titanium disc after different treatment. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001

Ra Rq Rz

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4.7 SEM 觀察不同清創處理後之鈦板表面

以 SEM 觀察經不同處理後之鈦板表面可以發現 Group 1 中之鈦板表面是非 常乾淨的，僅能看見 Grade IV 鈦板呈現一致的粗糙紋路走向。Group 2 在接種 72 小時的鈦板上可以看見 P. gingivalis 呈現群聚的分佈並覆蓋鈦板表面(Fig. 4-2(b)(b´))，並隨著表面的粗糙情形呈現起伏的分佈。在 Group 3 處理中，即便使 用 0.12%CHX 做沖洗，在一些凹陷的位置，可以看見 P. gingivalis 仍然呈現群聚 的分佈，無法完全被移除(Fig. 4-3(c)(c´))。而在 Group 4 使用 Ti 金屬刮匙處理後，

刮匙都會造成鈦板表面產生方向性刮痕，且無法清除躲在鈦板結構較深處的細菌 (Fig. 4(d)(d´))，此外 Group 4 表面出現了一些亮白的不規則顆粒如下圖 Fig. 4-18 (a) Spectrum2，經由元素分析後發現含有 Ti 的成份為 82.6%，C 的成份為 3.65%，

表示鈦板的表面在刮除後出現了一些包含細菌殘餘的不規則鈦金屬顆粒在鈦板 表面，也能夠看到細菌沒有被完全清除的結果，這顯示在臨床上使用刮匙進行清 創可能也會有類似情形。

Fig. 4- 18 EDS of titanium disc after Ti curette treatment.(a)Spectrum 2(b) Spectrum 3 (a)

(b)

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在 Group 5 使用 Laser 處理後的表面，從 SEM 下並沒有出現如 Group 4 亮白的不 規則顆粒，下圖 Fig.4-19 的 Spectrum 1 經表面的元素分析可以發現為鈦板的表 面，Ti 的成份為 100%，表示 Er:YAG 雷射的結果可以達到滅菌。

Fig. 4- 19 EDS of titanium disc after laser treatment.

而 Group 6 使用鈦金屬刮匙加上 Laser 處理後的表面，從 SEM 下可以看見出現 水平及垂直方向的刮痕，在刮痕凹陷的不規則部分進行元素分析，Fig.4-20 的 Spectrum 1 經表面的元素分析可以發現，Ti 的成份為 88.76%，但仍有 C 的成份 為1.9%，相對於 Group 4 的 C 的成份為 3.65%，表示 Group 6 處理過後相對於只 有鈦金屬刮匙處理的 Group 4 有較好的滅菌結果。

Fig. 4- 20 EDS of titanium disc after Ti curette and laser treatment.