第三章 實驗材料與方法
3.7 細胞實驗
3.7.1 細胞解凍、培養、計數與保存方法
本實驗所使用的細胞株為 Human gingival fibroblast(HGF) cells。
(1). 細胞解凍
【實驗步驟】
1. 將細胞培養液放入 37℃水浴槽中加溫。
2. 將細胞從-80℃冰箱中取出，以水浴槽加熱使細胞回復常溫狀態。
3. 以電動吸取器(pipet-aid)取 10ml 細胞培養液到細胞培養皿中。
4. 將回溫的細胞加入培養皿中，左右搖晃使其分散均勻。
5. 在顯微鏡底下觀察細胞，確認細胞數量與細胞狀況，並放入 5% CO2，37℃
的恆溫培養箱中培養。
6. 培養 24 小時後吸除舊有的培養液，因當中含 DMSO 對細胞有毒害，再加入 新的細胞培養液進行培養。
(2). 繼代培養
【實驗步驟】
1. 將水浴槽開啟至 37℃，放入 PBS、培養液及 trypsin。
2. 吸除舊有的細胞培養液。
3. 沿著培養皿壁加入 5ml 的 PBS，沖洗舊有細胞。
4. 吸除沖洗之 PBS，加入 trypsin 1ml。
5. 輕拍培養皿，並搖晃使 trypsin 能均勻分布。
6. 放入 5% CO2，37℃恆溫培養箱中，約 5 分鐘後取出，再次輕拍培養皿，並 於顯微鏡底下觀察細胞是否飄起。
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7. 加入 1ml 細胞培養液中止 trypsin 之反應。
8. 以 1000rpm 離心 5 分鐘，使細胞沉澱於底部，白色之沉澱即為細胞 pellet。
9. 吸掉上清液，加入新的細胞培養液 1ml，pipetting 打散細胞團塊。
10. 將上述細胞培養液加到含有 9ml 細胞培養液之培養皿中，放到 37℃、5% CO2
細胞恆溫培養箱中。
(3). 細胞計數
【實驗步驟】
1. 重複繼代培養步驟 1~9，取 100μl 的細胞液於 1.5ml 微量離心管中。
2. 加入 100μl 的 trypan blue 與細胞液混合。
3. 將蓋玻片蓋在血球計數器上，接著將細胞懸浮液充分混均勻，吸取 10μl 細
胞液，加入血球計數器及蓋玻片之間的空隙中。
4. 將血球計數器於顯微鏡底下計數，血球計數板中間細刻 9 個 1mm2大正方形，
其中四個角落之正方形再細刻為 16 個小格，深度均為 0.1mm，而每個大正 方形之體積為 1mm2 0.1mm。
5. 計算 4 個角落的大正方形內細胞數目，除以 4 再乘以 104，即為每 1ml 中細 胞之數目。
(4). 冷凍保存
【實驗步驟】
1. 冷凍保存前先確定細胞是否有受到汙染。
2. 配置冷凍保存液 : 500μl DMSO + 新鮮培養液 9.5ml 至 15ml 離心管，固定 DMSO 濃度 5~10%。
3. 以 125xg 離心 10 分鐘將細胞上清液去除後，各取 5ml 含 DMSO 的冷凍保存 液在離心管內均勻沖散細胞。
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4. 將細胞液各取 1ml 加到 2ml 無菌塑膠冷凍小管內，標明記號。
5. 冷凍管置於漸凍盒內，放在-80℃冰箱中長期保存，需要時再解凍。
3.7.2 免疫螢光染色及 HGF 細胞貼附鈦金屬板之定量分析
不 同 種 類 之 細 胞 膜 、 細 胞 質 或 細 胞 核 可 能 具 有 特 定 蛋 白 質 ( 例 如 : T lymphocyte 為 CD4+之細胞)，可以該特定蛋白質為該種類細胞之 marker，並以專 一性抗體結合配合呈色反應進行確認。本實驗使用可與 double strand DNA 結合
8. 以ActinGreen™ 488 ReadyProbes™ Reagent 室溫下避光染色 30 分鐘。
9. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。
10. 以 DAPI 於室溫下避光染色 10 分鐘(1:1000 dilution, 10 ng/μl)。
11. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。
12. 將試片放在載玻片上加入 anti-fade mounting solution 30μl，並以蓋玻片蓋上，
避光保存。
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13. 以共軛焦螢光顯微鏡觀察做細胞計數觀察紀錄每單位平方釐米的細胞數量 (cell number/mm2)。
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