探討鉺雅鉻雷射對粗糙鈦板表面牙周病致病菌的殺菌效果和細胞貼附能力

國立臺灣大學牙醫專業學院臨床牙醫學研究所 碩士論文

Graduate Institute of Clinical Dentistry School of Dentistry

National Taiwan University Master Thesis

探討鉺雅鉻雷射對粗糙鈦板表面牙周病致病菌的殺菌 效果和細胞貼附能力

In vitro evaluation of the bactericidal effect and fibroblast attachment on contaminated rough titanium surfaces

treated with Er : YAG laser

張雅婷 Ya-Ting Jhang

指導教授：陳漪紋 博士 Advisor: Yi-Wen Chen, Ph.D.

中華民國 107 年 7 月

July 2018

i

誌謝

時光飛逝，還記得兩年前剛進入實驗室認識新的環境，心情很慌張與不安，

一開始連最基本的 pipette 都摸索好久才回憶起該如何使用。如今，看著自己的

論文能夠付梓成冊，心中的激動與歡喜實非短短幾句可言。回首過去的這段日子，

真的要感謝許多人，如果沒有這麼多人的協助與鼓勵，我大概很難能夠完成這個 研究。

感謝一開始帶領我的口生所光劭學長，教我養細菌的技巧，如何去判斷細菌 的活性，調配培養液等等，即使在當兵期間也願意和我通話作遠端的教學，也一 直鼓勵培養細菌不順利的我，要再想辦法取得新的菌源。口生所的人尹學長及天 儷學姊也在光劭離開之後幫助我很多，教我儀器的使用以及耗材該如何取得。

謝謝我的大學同學竣為，教我電子顯微鏡前的樣本製備，一開始沒經驗從酒

精的序列性脫水到臨界點乾燥和鍍金機都要花上6~7 小時，我不知道這麼耗時，

跟他約下診之後教學，他竟然願意教我，那一天我們差點趕不上末班捷運回家，

之後還教我醫院1 樓電子顯微鏡的操作，真的是友情贊助啊！

謝謝根管治療科的耀仁學長，帶我去思亮館學習另一台貴儀的電子顯微鏡，

且不厭其煩地讓我嘗試拍攝確定到我會為止，佔用到他拍攝的時間真的是不好意 思。

謝謝一起從彰化秀傳離開後一起在台大臨牙所奮鬥的俊傑，我們一起在 329 做實驗，分享心得與鼓勵對方，真的是很難忘的三年！

謝謝在實驗室中的助理們，最一開始認識的是佩勳，她也抽空教我使用臨界 點乾燥機，和拍攝電子顯微鏡，幫我跟別家的助理借材料，也遠從八共取得一些 我要的藥劑先讓我應急，跟我分享訂哪家的耗材比較便宜等等，有幾次假日來做 實驗遇到儀器問題需要疑難排解時，都會傳訊息問她，她也都很有耐心地解決我 的問題。後來遇到了昱嘉，他是個態度很好總是笑臉迎人的助理，也經由他將藥 品櫃重新編號和整理，讓我們在找藥品時都能很快地找到，耗材不足時，他也都

ii

能很快地幫忙訂購，在實驗室中我們都在養細菌和染細菌，所以會互相分享心得

與技巧，也一起去醫學院學共軛焦顯微鏡LSM780 的拍攝，真的是很難忘的學習

經驗，希望他能堅定地朝他的目標繼續邁進。謝謝我們家的助理藝馨，在細胞實 驗上幫忙我很多，也教我養細胞的流程和分盤等細節，一些耗材的訂購都會跟各 家廠商比價，做事情很有效率，有她在，讓我在臨床和實驗中可以分擔一些負荷，

真的很感謝她。謝謝維萩，教我封片的技巧也願意分享給我二共拍攝的資訊，謝 謝她不吝於分享借我封片膠讓我使用。謝謝冠廷，常常用到臨界點乾燥機的二氧 化碳不足，都是她在幫忙訂購二氧化碳及分配各家的費用為如何，遇到許多困難 也都要麻煩她協助解決真的很感謝她。

謝謝我的陳家大師兄建成學長與二師兄柏翰學長，即使他們畢業了，但在門 診遇見他們都會關心我的研究進度，閒話家常一番我又有動力繼續向前進了，謝 謝他們給我的鼓勵。謝謝我的研究所同學振邦，在細胞實驗中也願意花時間教我 培養和分盤，最後的日子我們常在實驗室和臨床往返奔波，彼此互相鼓勵堅持下 去才能一起完成各自的研究順利畢業，這份情誼真的很難忘。感謝手術室的淑華 和玉璘兩位護理師，常常需要借用雷射做實驗，她們都會協助我設定設備及等待 我用完，有幾次還差點耽誤她們的下班時間，遇到挫折時，她們也都會給予我鼓

勵，幫我打氣加油！謝謝曉蓉，那天下午陪我將最後一批200 片鈦板一個一個的

做滅菌包裝，還對我的研究充滿興趣，看到電子顯微鏡的圖她也很激動，難得可 以遇見知音的感動。謝謝羅大哥，常常在實驗的時間與門診衝突時，都協助電話 聯絡幫我調整病人，後期常常麻煩他真的很感謝他，希望他保重身體，感冒也快 好起來。謝謝欣秀，當我遠在高雄做實驗時，給我打氣和鼓勵，平常也都給我很 多的關心，身邊有這麼多人的支持，真的很幸運！

謝謝工學院的粉粒體實驗室的陳先生和曉萍姊，陳先生會協助我的預約聯絡 事宜，曉萍姊則是協助我一起拍攝電子顯微鏡，我們不斷的在拍攝的過程中去發 現問題並修正我的實驗操作步驟，帶領我去思考可能是什麼原因造成現在這個結

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果。謝謝高醫的賴辰雄教授及研究特助Ben，提供我們很好的厭氧設備去培養細

菌，謝謝 Ben 不厭其煩地重新教我如何培養 P. gingivalis，分享我們許多養菌的 小技巧並點出我可能失敗的原因為何。感謝台大醫學院第一共研的顯微影像核心，

提供這麼高階的共軛焦顯微鏡讓我們能拍攝出很震撼的照片，謝謝 1448 的華蔓

姊，拍攝每台顯微鏡的教學影片，並幫我們做上機考核認證，確定我們會使用才 讓我們預約時間操作，遇見儀器有問題時，都會立即幫我們解決，拍攝時數不足 時，都願意再額外開放權限讓我預約，真的很感謝她。

謝謝共同指導的李伯訓教授，總是在進度報告中，提醒我還有什麼不足的地 方可以再去釐清的地方，教我操作接觸角儀器及表面粗糙儀，讓我們能夠發現實 驗中的許多細節。謝謝郭彥彬教授在study club 及論文口試時給予我們許多的意 見和想法，讓我們能知道實驗中的不足以及還能夠修正的地方。謝謝口試委員林 泰誠助理教授，藉由他的雷射研究及臨床經驗分享，讓我們思考未來的研究方向 及材料設備的選擇。謝謝王振穎醫師，在臨床案例的討論中，對於雷射給予我需 多操作上的想法，從每位老師的意見中可以獲得不同的思維和收穫。特別感謝我 的指導教授陳漪紋助理教授，給予挫折的我打氣和鼓勵，陪伴我抽絲剝繭去找到 問題的核心，也協助我找到能幫我們解決問題的人，願意接受我的意見，讓我去 買昂貴的染劑去染細胞和細菌，謝謝您對我的信任及看重，讓我能在最後這一年 有機會去學習到很多儀器的操作和實驗，讓我們的實驗能更臻完善，並提醒我藉 由碩士班的研究其實是要訓練我們邏輯思考的能力，以前不是很明白，但隨著實 驗接近尾聲以及在撰寫論文的過程中，去找尋答案的過程，我漸漸能夠明白這其 中的道理了！

在實驗的過程中，一開始面對培養厭氧菌真的挫折很多，有一段時間我一直 逃避不想踏進實驗室，後來歷經半年終於培養成功，我終於在電子顯微鏡看到粒 粒分明的它，難以忘記那個瞬間有多麽感動！謝謝我的精神良師柯文哲市長，他 曾經說過：「面對挫折打擊不是最困難的；最困難的是面對各種挫折打擊，卻沒

iv

有失去對人世的熱情。」也因為這段話讓低潮的自己去思考，必須鼓起勇氣再重 新面對它才行。謝謝這一路上，父母、姊姊及姊夫、男友的鼓勵與支持我才能順 利的完成我的學業。

謹將此篇論文獻給自己與所有關心我、我最愛的師長、家人與朋友們！

張雅婷 誌於 台大牙醫專業學院 臨床牙醫學研究所 西元2017 年 7 月

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摘要

背景：人工植牙使用於重建咬合已經有60 年的歷史，研究指出植體周圍炎的盛

行率很高，而目前尚沒有一個有效的方式去完全解決植體周圍炎的問題，因此本 研究想要藉由鉺雅鉻雷射的介入去觀察模擬植體周圍炎的鈦板其滅菌情形及其 後續的細胞貼附結果。

實驗材料與方法：本實驗使用四級純鈦的鈦板，共有六個組別，第一組是對照組 只有鈦板，第二到第六組接種 P. gingivalis 模擬植體周圍炎。第三組將其使用 0.12%的氯己定做沖洗；第四組使用鈦金屬刮匙做清創；第五組使用鉺雅鉻雷射 做滅菌；第六組先使用鈦金屬刮匙再合併鉺雅鉻雷射做滅菌。接著使用電子顯微 鏡觀察鈦板表面的情形，並藉由螢光染色觀察P. gingivalis 活/死菌的分佈情形，

以及測量表面粗糙度及接觸角的分析，並觀察不同處理後細菌的內毒素是否有改 變，後續在螢光顯微鏡下進行牙齦纖維母細胞貼附的觀察。

實驗結果：實驗的研究結果顯示，單純使用0.12%的氯己定無論是滅菌效果或細

胞貼附情形都不佳。鈦金屬刮匙的滅菌效果雖不錯但對於細菌內毒素似乎作用有 限，且鈦板的表面被改變。鈦金屬刮匙與雷射對於移除細菌同樣有效，雖然電子 顯微鏡的定性分析顯示雷射組別殘存細菌量較少，但兩組在螢光分析上並未有統 計上的顯著差異。第五組和第六組經雷射處理的結果，內毒素減少的效果為最佳。

細胞貼附的情形以第六組為最佳，但和第四組及第五組並不具有統計上的顯著差 異。

結論：就目前的研究結果來說，鉺雅鉻雷射可以有效於移除鈦板上地細菌和內毒 素對於後續人類牙齦纖維母細胞貼附情形都有極佳的結果，後續還會使用骨母細 胞做進一步的測試與分析。

關鍵詞：鉺雅鉻雷射, 牙齦卟啉菌, 人類牙齦纖維母細胞, 粗糙鈦金屬表面, 植 體周圍炎

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Abstract

Studies have reported a high prevalence of peri-implantitis with radiographic marginal bone loss. Evidence to date indicates that no available treatments result in total resolution of established peri-implantitis. The aim of this study was to investigate the bactericidal effect and fibroblast attachment on contaminated titanium surface treated with erbium-doped yttrium aluminium garnet (Er:YAG) laser.

Materials and Methods: Grade IV titanium discs were incubated with a suspension of Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) (ATCC® 33277TM) in brain heart infusion (BHI) broth. Six groups (n=6) with a total of 36 titanium discs were prepared. Group 1 was the negative control. Group 2 to 6, titanium discs were incubated with P. gingivalis biofilm. Group 3, 0.12 % Chlorhexidine was used for irrigation. Group 4, titanium curette was used for debridement. Group 5, Er:YAG laser irradiation was performed at pulse energy 80 mJ and frequency 25 pulse per second. Group 6, Curette debridement was followed by Er:YAG laser irradiation. After various treatments, surface roughness and hydrophilicity were measured. The residual bacterial was examined by scanning electron microscope and confocal laser scanning microscope, and the residual lipopolysaccharide was examined by Lymulus amoebocyte lysate (LAL) assay. Then, the adhered human gingival fibroblast (HGF) cells were quantified by fluorescent microscope.

Results: Chlorhexidine irrigation or curette debridement alone couldn’t remove bacteria efficiently. Titanium curette could remove bacteria efficiently, but had limited effect on LPS. Er:YAG laser alone could remove bacteria as effective as titanium curette, and Er:YAG laser was most effective in removing LPS. Er:YAG laser combined with curette debridement has highest amount of adhered HGF cells. Though there was no significant difference between titanium curette, Er:YAG laser, and combined group.

vii

Conclusion: Er:YAG laser would be a promising therapy to treat peri-implantitis by removing bacterial remnants without altering titanium surface. Further studies are warranted to evaluate the potential of osteoblast adhesion after Er:YAG laser treatment.

Keywords: Er:YAG laser, Porphyromonas gingivalis, human gingival fibroblast, rough titanium surface, peri-implantitis

目錄

誌謝... i

摘要... v

Abstract ... vi

目錄... viii

圖目錄... x

前言... 1

第一章 文獻回顧... 2

1.1 植體周圍疾病(Peri-implant disease) ... 2

1.1.1 植體周圍致病菌... 2

1.1.2 Porphyromonas gingivalis 之特性 ... 3

1.2 雷射介紹... 6

1.2.1 牙科雷射... 6

1.2.2 鉺雅鉻雷射... 7

1.2.3 鉺雅鉻雷射於牙周病的治療... 8

1.2.4 鉺雅鉻雷射於植體周圍炎的治療... 10

第二章 實驗動機與目的... 12

2.1 研究動機... 12

2.2 研究目的... 12

第三章 實驗材料與方法... 13

3.1 實驗材料... 13

3.2 實驗儀器... 20

3.3 實驗流程圖... 21

3.4 鈦金屬板之處理... 22

3.5 細菌實驗... 22

3.6 模擬臨床移除生物薄膜之處理... 26

3.7 細胞實驗... 28

3.8 表面內毒素殘留分析... 32

3.9 表面接觸角分析... 34

3.10 表面粗糙度分析... 36

第四章 實驗結果... 38

4.1 SEM 觀察不同清創處理後之鈦板表面 ... 38

4.2 共軛焦顯微鏡觀察清創處理後鈦板表面活菌死菌分佈情形... 41

4.3 模擬臨床移除生物薄膜處理後之細胞貼附定量試驗... 45

4.4 表面內毒素殘留分析... 50

4.5 表面接觸角分析... 52

4.6 表面粗糙度分析... 54

4.7 SEM 觀察不同清創處理後之鈦板表面 ... 55

第五章 討論... 57

5.1 鉺雅鉻雷射的輸出功率... 57

5.2 0.12 % CHX 沖洗與滅菌效果的關係 ... 58

5.3 影響 HGF 細胞貼附的可能原因... 58

5.4 鉺雅鉻雷射的殺菌效果與細胞貼附情形... 60

5.4 In vitro 研究中與臨床操作的差異 ... 61

5.5 未來的展望... 61

第六章 結論... 62

第七章 參考文獻... 63

圖目錄

Fig. 1- 1 Schematic structure of lipopolysaccharide (LPS) of the outer membrane of P.

gingivalis. (Ogawa & Yagi, 2010). ... 5

Fig. 3- 1 實驗流程圖如下所示 ... 21

Fig. 3- 2 in vitro 模擬植體周圍炎實驗流程 ... 25

Fig. 3- 3 移除生物薄膜之流程及分組圖 ... 26

Fig. 3- 4 內毒素動力濁度法實驗原理 ... 32

Fig. 3- 5 Schematic diagram of contact angle... 34

Fig. 3- 6 粗糙儀測量鈦板表面粗糙度之示意圖 ... 37

Fig. 4- 1 SEM images of (a) Group 1 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (a´) Group 1 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 38

Fig. 4- 2 SEM images of (b) Group 2 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (b´) Group 2 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 38

Fig. 4- 3 SEM images of (c) Group 3 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (c´) Group 3 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 39

Fig. 4- 4 SEM images of (d) Group 4 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (d´) Group 4 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 39

Fig. 4- 5 SEM images of (e) Group 5 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (e´) Group 5 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 40

Fig. 4- 6 SEM images of (f) Group 6 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (f´) Group 6 of P.gingivalis, magnification 10000 X ... 40 Fig. 4- 7 Representative fluorescence images(63X) with live(green)/dead(red) stain of P. gingivalis ATCC 33277 adhesion on rough titanium discs surface after different treatment. Panel (a): Group 1. control ; Panel (b): Group 2. P. gingivalis; Panel (c):

Group 3. 0.12% CHX... 41 Fig. 4- 8 Representative fluorescence images(63X) with live(green)/dead(red) stain of P. gingivalis ATCC 33277 adhesion on rough titanium discs surface after different treatment. Panel (d): Group 4. Ti curette ; Panel (e): Group 5. Laser; Panel (f):

Group 6. Ti curette + laser. ... 42 Fig. 4- 9 Mean intensity of SYTO 9 and Propidiun iodide after different treatment.

*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ... 44 Fig. 4- 10 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment from 24 hours to 120 hours. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001... 46 Fig. 4- 11 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 24 hours. ... 47 Fig. 4- 12 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 72 hours. ... 48 Fig. 4- 13 HGF cell adhesion assay (cell number per mm²). The cell adhesion number on contaminated titanium discs after different treatment at 120 hours. ... 49 Fig. 4- 14 The residual lipopolysaccharide over titanium discs after various treatments using a UV Spectrum absorbance at 545 nm. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 .. 51 Fig. 4- 15 Contact angle of P. gingivalis biofilm after different treatment. (a) Group 1 (b) Group 2 (c) Group 3 (d) Group 4 (e) Group 5 (f) Group 6 ... 52 Fig. 4-16 Contact angle of P.gingivalis biofilm after different treatment. *p<0.05

**p<0.01 ***p<0.001 ... 53 Fig. 4-17 Surface roughness analysis of Ra Rq and Rz of P. gingivalis inoculation on titanium disc after different treatment. *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001... 54 Fig. 4- 18 EDS of titanium disc after Ti curette treatment.(a)Spectrum 2 (b) Spectrum 3... 55

Fig. 4- 19 EDS of titanium disc after laser treatment. ... 56 Fig. 4- 20 EDS of titanium disc after Ti curette and laser treatment. ... 56

前言

對於局部缺牙的患者，人工植牙的介入在咬合重建治療變得越來越常見，但 也隨著使用的頻率變高，植體相關的併發症其盛行率也越來越高。而植體所產生 的併發症最嚴重為植體周圍炎(peri-implantitis)，他是在產生骨整合的植體周邊 產生發炎的反應，進一步造成植體周邊的骨頭喪失。而造成此疾病的進展主要是 植體周邊堆積的細菌生物薄膜形成所導致。因此移除植體表面的生物薄膜變成治 療植體周圍炎的首要目標。儘管造成植體周圍炎的致病菌與牙周病的致病菌有些 許雷同之處，但因為植體的表面處理及結構有許多變異，造成植體周圍炎在治療 時比自然牙的牙周病來得複雜許多。

許多傳統的治療方針包含塑膠刮匙(plastic curettes)，音波及超音波器械 (sonic, ultrasonic scalers)，以及噴砂等方式(air powder flow systems)被用來作為 植體表面的去毒性及清創(detoxification and debridement)的方式。然而上述的 方式並不足以完全地移除粗糙植體表面上的細菌生物薄膜。而使用鈦金屬刮匙 或音波及超音波器械可能會造成植體表面的結構改變，進而影響後續的細胞貼 附並干擾骨整合的過程。本研究利用in vitro 模擬植體周圍炎之情形，在鈦金屬 板上使用各種臨床常用的治療方針並加入鉺雅鉻雷射，分析鈦板在牙周致病菌 感染及治療後鈦板表面影響牙齦纖維母細胞的貼附及表面殘留內毒素之情形，

期望能夠提供未來治療植體周圍炎之方針。

第一章 文獻回顧

1.1 植體周圍疾病(Peri-implant disease)

植體周圍疾病(Peri-implant disease)被定義為黏膜組織有發炎的情形，臨床的 症狀包含紅、腫、探測出血以及化膿的情形。植體發炎的情形侷限在植體周圍的 黏 膜 ， 此 病 兆 尚 未 造 成 植 體 周 圍 骨 頭 破 壞 ， 稱 為 植 體 黏 膜 炎(Peri-implant mucositis)；而當植體周圍支持的骨頭出現骨吸收的情形時，則被定義為植體周圍 炎(Peri-implantitis) (Zitzmann & Berglundh, 2008)。

植 體 周 圍 炎 的 分 類 主 要 是 根 據 疾 病 的 嚴 重 程 度 (Froum & Rosen, 2012;

Zitzmann & Berglundh, 2008) 或 者 近 期 是 以 病 因 為 主 (Sarmiento, Norton, &

Fiorellini, 2016)，主要包含的病因可歸因於以下五點：

1.   致病菌(Pathogenic bacteria)

2.   外源性的刺激(Exogenous irritants) 3.   醫源性的因子(Iatrogenic factors) 4.   (Extrinsic pathology)

5.   缺乏角化組織(Absence of keratinized tissue, AKT)

其中又以致病菌佔了最高的比例，高達 78.8%，因此消除致病菌成為治療植 體周圍疾病最主要的課題。

1.1.1 植體周圍致病菌

牙 周 致 病 菌 與 植 體 周 圍 的 病 菌 是 有 相 關 連 的 ， 包 含 Aggregatibacter actinomycetemcomitans ， Porphyromonas gingivalis ， Tannerella forsythia and Treponema denticola(Holt & Ebersole, 2005)， 其 中 具 有 黑 色 素 的

Prevotella species，A. actinomycetemcomitans，P. gingivalis 在植體周圍炎的病灶 區相較於健康的部位是有比較多的現象(Shibli et al., 2008)。

在一個研究指出中，當患者有治療過牙齦炎或牙周炎時，當他們植牙後的 30 分鐘後可以偵測到牙周的致病菌包含 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia(Furst, Salvi, Lang, & Persson, 2007)。

而在另一篇的研究指出，植體的 abutment 接上後的一週後也同樣可以偵測到牙

周的致病菌(Quirynen et al., 2006)。

在一篇回溯性的橫斷面研究指出，經過植入植體後十年，去分析 503 支植體 與 493 顆臨牙的菌種分佈，發現植體周邊比牙齒出現較高比例的 T. forsythia, Parvimonas micra, F. nucleatum / necrophorum 以及 Campylobacter rectus 等致病 菌。其中大多數的菌種在植體與自然牙的出現比率呈現高度的相關性，而其中又 以P. gingivalis (R = 0.503)的相關性為最高(Eick et al., 2016)。

在 2016 年也有一篇系統性回顧的研究提及主要造成植體周圍炎的細菌是屬 於 red complex 中 的 革 蘭 氏 陰 性 厭 氧 菌 (Gram-negative, anaerobic pathogenic bacterium)，包含 Porphyromonas gingivalis，Tannerella forsythia 以及 Treponema denticola (Perez-Chaparro et al., 2016)。因此我們的實驗用的細菌主要是選擇 Porphyromonas gingivalis。

1.1.2 Porphyromonas gingivalis 之特性

Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis) 是在口腔中的厭氧菌，它會產生發炎 反應造成牙齒周圍組織的破壞，最終甚至造成牙齒喪失，我們稱此為牙周病

(periodontitis)。而在我們口中有超過 500 種以上的細菌存在我們口腔內，其中包

含P. gingivalis, T. denticola,以及 T. forsythia 的紅色菌屬“red complex”被認為和我

們牙周疾病的病灶最有關聯(Bodet, Chandad, & Grenier, 2007)。

P. gingivalis 為慢性牙周炎(chronic periodontitis)之主要病菌，也會出現在植 體 周 圍 炎 之 菌 叢 中 ， 為 革 蘭 氏 陰 性 絕 對 厭 氧 球 桿 菌(cocobacillus)。由於 P.

gingivalis 之出現會造成口腔內菌群的失調 (dysbiosis)及改變宿主之免疫反應而 引發發炎反應，而被稱為是形成牙周病的關鍵病菌(Hajishengallis, Darveau, &

Curtis, 2012)。

研究指出 P. gingivalis 能夠進入牙齦上皮細胞 (gingival epithelial cells)及免 疫細胞中而不被殺死，且能夠在細胞之間散佈(Guyodo et al., 2012; Lamont et al., 1995; O. Yilmaz, Verbeke, Lamont, & Ojcius, 2006)。P. gingivalis 具有許多躲避宿 主免疫系統的方式，例如:藉由外膜囊泡的 lipid raft-dependent 的方式進入並躲藏 在宿主的endosome、autophagosome 中，也可以避免 autophagosome 與 lysosome fusion(Belanger, Rodrigues, Dunn, & Progulske-Fox, 2006; Dorn, Dunn, & Progulske- Fox, 2002; Lamont et al., 1995)，這些都是能夠躲避宿主免疫系統且能同時獲得養 分的方式。

P. gingivalis 有許多 virulence factors 如:脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)、菌 毛 (fimbriae)、蛋白酶及膜外蛋白能破壞先天性免疫反應及產生發炎反應;在 P.

gingivalis 製造的 virulence protease 包含 arginine gingipains (分為 HRgpA 及 RgpB) 及Lysine gingipain (Kgp)。Gingipain 可以切割並降解膠原蛋白及結締組織之基質，

也被報導會破壞牙周組織、降解cytokines、去活化(deactivate)宿主補體系統以及 切割細胞之receptor 如:巨噬細胞之 CD14 (與先天性免疫活化相關)、T 淋巴球之 CD4 (輔助型 T 細胞之 marker)及 CD8 (胞殺型 T 細胞之 marker) (Potempa, Sroka, Imamura, & Travis, 2003)。

脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)為革蘭氏陰性菌製造，又稱內毒素，是革

蘭氏陰性菌的外膜，也是P. gingivalis 所分泌的 virulence factor 之一。對於細菌 而言內毒素可以保護其不受一些化學物質的攻擊，也提供負電荷以穩定細胞膜

的完整性。當內毒素大量進入血液中時，內毒素作用於免疫細胞中，使IL-1、

IL-6 及 TNF-α 等 inflammtory cytokines 大量表現，引起過度的免疫反應，嚴重

時甚至會造成內毒素休克。內毒素非常頑強，須經250℃處理 3 小時才能使其

失去活性。脂多醣 (LPS)是由三個構造組成：1. O-antigen 是免疫系統辨認的主 要對象，其是由多醣 (polysaccharide)所組成。 2. Lipid A 是以

phosphoglucosamine disaccharide 為中心，接上許多脂肪酸所組成，是內毒素引 起免疫反應的主要構造。 3. Core 是連接 O-antigen 及 Lipid A 的構造，由寡糖 組成。

Fig. 1- 1 Schematic structure of lipopolysaccharide (LPS) of the outer membrane of P.

gingivalis. (Ogawa & Yagi, 2010).

Gao 等學者以不同濃度之 P.gingivalis 內毒素處理 osteoblast 及 osteoclast，結 果發現隨著濃度的提高，osteoblast 之活性有下降的趨勢，而 osteoclast 之活性則

有上升趨勢，顯示P. gingivalis 內毒素與臨床齒槽骨再吸收的現象相關(Gao et al., 2016)。Madeira 等學者經由動物實驗發現 A.actinomycetemcomitans 之內毒素會使 小鼠之齒槽骨再吸收(Madeira et al., 2013)。

1.2 雷射介紹 1.2.1 牙科雷射

雷射(Laser)是 Light Amplified by Stimulated Emission of Radiation 的簡稱，簡 單來說是指對某一物質給予一定能量刺激後所放射出一特定波長，同一相位的電

磁波，再加以聚焦並放大能量所形成。其理論架構最早是由愛因斯坦於 1905 年

所提出，根據此一理論，Maiman 工程師在 1960 年成功製造出全世界第一台雷射 機(紅寶石雷射)，最早在牙科方面的應用是在體外試驗去除齲齒，當時能量密度 的設定為9’000 J / cm² (Goldman, Hornby, Meyer, & Goldman, 1964) 。不僅如此，

牙科雷射廣泛的應用在許多領域包含根管治療、牙周病學、人工植體學、矯正學 及口腔外科等領域(Green, Weiss, & Stern, 2011)，和組織的作用原理包含氣化 (vaporization)，止血(hemostasis)，生物刺激與調節(biostimulation&biomodulation)，

軟組織切除，殺菌等。

牙科雷射的種類有許多，包含二氧化碳雷射(Carbon dioxide)，Nd:YAG laser，

鉺雅鉻鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)，水雷射(Er,Cr:YSGG)，及二極體雷射(diode lasers)，上述此五種雷射都可以使用在口內軟組織的手術，針對口瘡做治療，以 及囊袋內的清創，而比較常用在牙周病治療的是Er:YAG 和 Er Cr YSGG 這這兩 種雷射，波長分別是 2940nm 和 2780nm，這兩種雷射除了一般的軟組織切除 (ablation)及清創(debridment)，也具有切削硬組織及修整骨頭的作用。

1.2.2 鉺雅鉻雷射

鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)的波長為 2940 奈米(nm)，其特性為臨床手術可以 應用在軟硬組織，也可以移除牙齦下的牙結石。它的雷射光束對水吸收較好，比 CO2 雷射多十倍，比 Nd:YAG 雷射多 15000~20000 倍。由於他被水吸收較多，

所以經由Er:YAG laser 照射後僅會被表層所吸收，並不會穿透到深層的組織，因 此會有較少的組織變性(tissue degeneration)及較少的表層改變。 而它對於軟硬組 織的效用主要是藉由光能轉換成熱能(photo-thermal interactions)產生表面蒸散 (evaporation)的結果(Aoki et al., 2015)。

鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)，具有生物調節的作用(biomodulatory effects)。在 In vitro 的研究中，鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)對於對於刺激牙齦纖維母細胞的生 長也有相關的文獻。Ogita 學者等人在 2015 年的研究指出當鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)設定在低能量時，對於牙齦纖維母細胞在照射 24 小時候有刺激生長的結果，

經過蛋白質的分析，發現與 galectin-7 此蛋白可能參與此增生有關(Ogita et al., 2015)。Kong 學者等人將不同能量密度的鉺雅鉻雷射(3.6, 4.2, 4.9, 6.3, 8.1, or 9.7 J cm⁻² )以 20 或 30 赫茲(Hz)照射 20 或 30 秒的結果，藉由 WST-8 assay 以及結晶 紫染色(crystal violet staining)發現當能量密度設定在 6.3 J cm⁻²時，對於牙齦纖維 母細胞是具有促進細胞促進細胞增生的結果，儘管溫度會在 30 秒之內從 26.7 ± 0.1 °C 提升到 40.9 ± 1.4 °C，但對於細胞的生長，40°C 仍然屬於一個安全的溫度 (Kong et al., 2018)。

鉺雅鉻雷射(Er:YAG laser)被證實具有抗菌的效果。先前的研究指出在 37°C

培養 48 小時的有菌的培養皿施打雷射後，菌叢出現了被抑制生長的區域，這包

含齒髓致病菌(例如：Candida albicans, Enterococcus faecalis)(Meire, Coenye, Nelis,

& De Moor, 2012)以及牙周致病菌(例如：P. gingivalis)也有這樣的發現(Akiyama

et al., 2011)。

此外 Er:YAG laser 對於脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS)的作用在文獻中也有 提及，主要的理論是LPS 的吸收波長為 2920 nm 與 Er:YAG laser 的波長 2940 nm 是很接近的。所以在一個因矯正須拔除小臼齒的研究中指出施打Er:YAG laser 後 可以移除高達83.1%的 LPS(Yamaguchi et al., 1997)。

在牙周以及植體周圍疾病的治療包含許多抗菌處裡的方式。主要的目標就 是希望能夠達到徹底移除軟硬組織中附著的細菌讓後續貼附的表面是比較光滑 不易讓細菌再附著以及成為一個具生物相容性的表面，讓宿主的細胞能夠重新再 貼附(re-attachment)。

1.2.3 鉺雅鉻雷射於牙周病的治療

非手術治療

Aoki 在一篇 in vitro 的研究指出，鉺雅鉻雷射用來評估去除牙根表面牙結 石 的 可 行 性 ， 其 研 究 結 果 顯 示 當 能 量 設 定 在 30 mJ/pulse ( 能 量 密 度 : 10.6 J/cm2/pulse)10 pps 並搭配水沖洗時，能將牙根表面的牙結石清除，且作用的深度 只到牙骨質(ablation)，並不會造成更深層的破壞，因此提到此鉺雅鉻雷射可以作 為牙齦下牙結石清除的工具(Aoki, Ando, Watanabe, & Ishikawa, 1994)。而在 Aoki 學者另一篇的研究指出，經由組織學切片以及電子顯微鏡的觀察，經由雷射清除 牙結石的牙根表面與超音波振盪清除表面的結果並沒有顯得差異(Aoki et al., 2000)。

Schwarz 在非手術的牙周治療中，單獨使用鉺雅鉻雷射或合併使用雷射以及 金屬刮匙去觀察臨床追蹤一年的結果，兩者的治療並沒有統計上的顯著差異

(Schwarz, Sculean, et al., 2003a)。而在長達 24 個月的追蹤，Schwarz 等人在臨床 的研究指出使用鉺雅鉻雷射在清除牙根牙結石方面，牙周附連(clinical attachment) 可以維持到兩年的穩定度(Schwarz, Sculean, et al., 2003b)。

在治療牙周病時，使用超音波洗牙機以及施行牙根整平術，可以機械性的移 除生物薄膜達到良好的療效(Apatzidou & Kinane, 2010)，在一篇系統性文獻回顧 方面，鉺雅鉻雷射(Er:YAG lasers)在治療後追蹤三個月與使用超音波洗牙以及合 併施行牙根整平術(scaling and root planing)可以達到相似的療效(Zhao et al., 2014)。

手術治療

在動物實驗方面，Mizutani 等學者在 2006 年的研究指出，，比較鉺雅鉻雷 射與使用金屬刮匙在牙周翻瓣手術的應用。發現使用鉺雅鉻雷射無論是在牙根表 面清創還是去除肉芽組織都會比使用金屬刮匙所需要的治療時間短且不會造成 熱效應，此具有統計上的顯著差異。而在組織學上的發現，雷射的結果會比單純 使用金屬刮匙有更多的新生成骨頭(Mizutani et al., 2006)。

Taniguchi 等學者在 2016 年的研究指出，使用鉺雅鉻雷射清創後合併使用 EMD 及自體骨去做牙周再生手術。於 6 位患者共 9 個齒位追蹤一年後有良好的 結果，平均牙周囊袋從 6.2 mm 減少至 2.0 mm；平均附聯高吐；平均附連高度 (CAL)增加為 4.1mm；骨內缺損的高度從 6.0 mm 將低到 1.0 mm。其臨床的操作 方式，牙根清創有先使用牙周刮匙做牙根整平，接著鉺雅鉻雷射的使用是設定在 70 mJ/pulse 及 20 Hz 搭配生理食鹽水，針對一些死角作牙根表面的清創，接著使

用EMD 及自體骨填入骨缺損的位置，最後再以不噴水的模式，將鉺雅鉻雷射設

定在 50 mJ/pulse 及 20 Hz 將表層的血塊凝集後再將皮瓣縫合，此為一個新的方

式，將鉺雅鉻雷射使用在牙周再生的術式(Taniguchi et al., 2016)。

1.2.4 鉺雅鉻雷射於植體周圍炎的治療

在植體周圍疾病(Peri-implant disease)，非手術治療藉由機械性的移除生物薄 膜，目前看來似乎對於植體黏膜炎(Peri-implant mucositis)的處理比較有效而對植 體周圍炎(Peri-implantitis)並沒有並沒有太大的療效(Renvert, Roos-Jansaker, &

Claffey, 2008)。

鉺雅鉻雷射(Er:YAG lasers)在許多的研究中指出，可以做為治療的選擇來移 除牙齦下以及植體周圍的生物薄膜，藉由清創的結果達到減少牙周以及植體黏膜 周圍的發炎情形(Tomasi, Schander, Dahlen, & Wennstrom, 2006; S. Yilmaz et al., 2012)。

在植體周圍炎方面，有一篇統合分析的文章指出，在六個月的短期追蹤，鉺 雅鉻雷射(Er:YAG lasers)相對於傳統的超音波洗牙以及合併施行牙根整平術在牙 周囊袋的減少具有顯著的差異(p  =  0.018)，但在牙周附連的增加以及牙齦萎縮的

改變量則是沒有顯著差異。而當追蹤到 12 個月時，上述治療的因子，則是在兩

個組別之間都不具有統計上的顯著差異。因此這篇文獻的結論為鉺雅鉻雷射在短 期的追蹤有優於傳統的治療的效益，但在長期追蹤方面則沒有顯著的有效(Yan, Liu, Wang, Yin, & Xia, 2015)。

鉺雅鉻雷射對於植體周圍的維持(maintenance)也有相關的文獻提及，主要是 跟他本身的殺菌作用(bactericidal effect)，操作簡易，以及術後的腫痛較不容易產 生有關(Mason, 1992)。

Kreisler 等 學 者 在 in vitro 的 研 究 中 指 出 在 不 同 植 體 表 面 培 養 細 菌 Streptococcus sanguinis (ATCC 10556).，鉺雅鉻雷射在 60mJ, 10PPS 具有殺菌作用

(bactericidal effect)(Kreisler, Kohnen, et al., 2002)。且他在另一個動物實驗上，將 不同表面處理的植體植入豬的股骨中，模擬植體周圍炎的情形，接著使用鉺雅鉻 雷射去照射，發現並不會對於植體表面產生過熱的結果(Kreisler, Al Haj, &

d'Hoedt, 2002)。Matsuyama 在植體的 abutment 表面使用此雷射能有效清除牙菌 斑及牙結石並不會傷害表面的結構(Matsuyama, Aoki, Oda, Yoneyama, & Ishikawa, 2003)。而在一個 in vivo 的研究中，Schwarz 等人在植體的表面使用鉺雅鉻雷射 移除牙齦下的牙結石並不會造成植體表面有熱效應的破壞(Schwarz, Rothamel, &

Becker, 2003)。

Eick 等學者在 In Vitro 的研究中模擬植體周圍炎的研究中，將細菌培養在噴

砂酸蝕的表面 3.5 天後再將他放入模擬的囊袋中在進行四項處理後(1.鈦金屬刮

匙(titanium curettes)2. 鉺 雅 鉻 雷 射 (Er:YAG laser)3. 光 動 力 治 療 photodynamic therapy (PDT)4.鈦金屬刮匙合併光動力治療(CUR/PDT)，接著將上皮細胞，牙齦 纖維母細胞，類骨母細胞培養到各組，在分析其生長的情形。其後續結果發現，

鉺雅鉻雷射處理過的組別在細菌量減少為最多的，相對於其他三組處理後具有統 計上的顯著差異。而在細胞培養部分，上皮細胞的貼附在四組的處裡後統計上不 具有顯著差異，但在鉺雅鉻雷射處理的組別，相對於其他組而言，牙齦纖維母細 胞，類骨母細胞的生長，則是具有統計上的顯著差異，此為鉺雅鉻雷射處理後較 為有效的證據(Eick et al., 2017)。

12

第二章 實驗動機與目的

2.1 研究動機

人工植牙提供治療缺牙很好的選擇，但在臨床上因細菌感染所引發的植體周 圍炎則是植體失敗的主要原因；而植體周圍炎之治療在臨床上分為非手術型及手 術型，其中以手術型治療效果較佳，但目前仍無一套標準的流程；現今對於植體 周圍炎之研究多半集中於以不同的方式 (如:不同手術方法)或是比較不同材料 (如:不同 graft)，並透過長期追蹤其 PD 及 BOP 之變化觀察其成效。而植體改質 是針對會影響到骨整合的相關因子對植體之表面進行修飾；但是對於植體周圍炎 之後植體在材料學上的變化沒有人研究過。我們認為生物薄膜可能會造成植體在 材料性質上改變而變得不容易使細胞貼附，而細胞的貼附效率不佳也象徵後續骨 整合的效率不佳。在複雜的生物薄膜環境中，細菌有許多virulence factors，這些 物質不但可以保護細菌，也會造成體內免疫細胞的死亡，virulence factors 中如內 毒素會影響到細胞的分化及貼附，而在植體周圍炎的治療中也缺乏對內毒素等 virulence factors 清除的步驟，在經過治療之後這些物質是否仍殘留在植體上目前 也沒有相關研究。

由於目由於目前植體周圍炎尚沒有一個可以解決的方法，因此希望藉由模擬 植體周圍炎的情形藉由鉺雅鉻雷射的處理觀察其抗菌效果以及後續牙齦纖維母 細胞貼附的情形。

2.2 研究目的

1. 觀察以鉺雅鉻雷射處理過後的鈦板表面是否會有一些表面結構與粗糙度的

改變。

2. 經由鉺雅鉻雷射處理過後細菌量以及內毒素的含量是否會減少。

3. 觀察人類牙齦纖維母細胞在處理完的鈦板表面後續貼附的情形。

4. 探討影響人類牙齦纖維母細胞貼附的相關因子。

13

第三章 實驗材料與方法

3.1 實驗材料

(1) 第四級純鈦金屬板

Grade 4 Pure Titanium Disc (Ti disc) 邦杰材料科技股份有限公司

Chemical composition (wt%):

N≦0.05%, C≦0.08%, H≦0.015%, Fe≦0.5%, O≦0.4%, Ti:Bal.

Ra=1.1 μm

直徑=15 mm, 厚度=2mm

(2) 鈦金屬牙周刮匙

Periodonta Titanium Curette KOHLER 7103 KOHLER, Germany

直徑=8 mm Langer 7/8

(3) 腦心萃取液態培養基 Brain Heart Infusion (BHI) BD Bacto^TM, REF 237500 Composition:

藥品 重量(g) Calf Brains, Infusion from 200 g 7.7 Beef Heart, Infusion from 250 g 9.8 Proteose Peptone 10.0

14

Dextrose 2.0 Sodium Chloride 5.0 Disodium Phosphate 2.5 pH 7.4 ± 0.2

(4) 厭氧血液培養基

Anaerobic Blood Agar Plate (Ana. BAP) 啟新生技

(5) 酵母萃取物 Yeast Extract OXOID, LP0021

Straw, free flowing powder Formal Nitrogen 4.5 – 5.8%

Total Nitrogen 10.0 – 12.5%

(6) L-半胱氨酸鹽酸鹽 L-cysteine hydrochloride SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 52-89-1 M.W.=157.62

Linear Formula : HSCH2CH(NH2)COOH · HCl

15

(7) 刃天青鈉鹽

Resazurin sodium salt SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 62758-13-8 M.W.=251.17 Linear Formula : C12H6NNaO4

(8) 改良 Eagle 培養基

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Composition:

藥品 劑量 DMEM powder 1 package

Fetal Bovine Serum 100 ml NaHCO3 3.7 g

pH 7.2 ± 0.2

(9) 多聚甲醛

4% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 30525-89-4 M.W.=30.03 (as monomer) Linear Formula : HO(CH2O)nH

16

(10) 乙醇

Ethanol, (50、60、70、80、90、95、99%) HESTION

CAS : 64-17-5 M.W.=46.07 Linear Formula: CH3CH2OH

(11) 磷酸鹽緩衝液

Phosphate Buffered Saline (PBS) X10 倍 Corning^®

Composition:

藥品 重量(g)/L NaCl 80.0 KCl 2.00 NaH2PO4 16.33 K2HPO4 1.96 pH 7.4 ± 0.2

17

(

藥品 重量(mg)/L

Potassium Chloride 400.00

Potassium Phosphate monobasic 60.00 Sodium Bicarbonate 350.00

Sodium Chloride 8000.00 Sodium Phosphate dibasic 90.00 D-Glucose (Dextrose) 1000.00 EDTA-4Na．2H2O 200.00 Phenol Red 10.00

Trypsin 500.00

(13) 台盼藍 Trypan Blue

SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 72-57-1 M.W.=960.81 Linear Formula : C34H24N6Na4O14S4

pH 72-8.0

18

(14) 甲醇 Methanol

SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 67-56-1 M.W.=32.04 Linear Formula : CH3OH

(15) 二次去離子水: 實驗室自製

(16) 去熱原水

Limulus Amebocyte Lysate Reagent Water Lonza

Endotxin Content < 0.005 EU/ml

(17) 4',6-二脒基-2-苯基吲哚

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) BioLegend^®

CAS : 28718-90-3 M.W.=350.25

19

(18) Chlorhexidine 氯己定

SIGMA-ALDRICH^®

CAS : 55-56-1 M.W.=505.45

(19) Cobra 培養液 Cobra medium Medium formula:

藥品 含量 L-Cysteine hydrochloride 0.1g Brain heart infusion powder 7.2g Yeast extract 1g Resazurin solution 0.8ml Todd Hewitt Broth powder 6g

Distilled water 401.6ml

(20) Limulus amebocyte lysate (LAL) endotoxin assay kit (GenScript, Piscataway, NJ) (21) ActinGreen™ 488 ReadyProbes™ Reagent (Thermo Fisher Scientific)

20

3.2 實驗儀器

(1). 超音波震盪機 (Ultrasonic cleaner) : Transsonic Digital S, Elma (2). 電子天平 (Electronic balance) : HR-200, AND.

(3). 無菌操作台 (Clean bench) : 3BC-24, MIT.

(4). 無菌無塵操作台 (Clean bench) : High ten scientific corp, MIT.

(5). 高壓蒸氣滅菌鍋 (Autoclave) : TOMIN, TM-326.

(6). 生物分光光度計 (Biophotometer) : Eppendorf, Germany.

(7). 恆溫水浴槽 (Shaking bath) : SB302, Kansin

(8). 恆溫培養箱 (Incubator) : DB-72，見誠科技有限公司

(9). 二氧化碳細胞培養箱 (CO2 incubator) : MCO-17AC, SANYO Osaka, Japan.

(10). 厭氧產氣包 (Anaeropack) : Mitsubishi gas chemical company, INC., Japan.

(11). 臨界點乾燥儀 (Critical point dryers) : K850, Quorum.

(12). 真空鍍膜機 (Vacuum fine coat) : Q150RS, Quorum.

(13). 場發射掃描式電子顯微鏡 (Ultra-high resolution FE-SEM with low vacuum mode) : Nova^TM NanoSEM 230.

(14). 表面輪廓儀 (Microfigure measuring instrument) : Surfcorder ET200, Japan.

(15). 接觸角測量儀 (Contact angle) : FTA32, First Ten Angstroms Inc., England.

(16). 內毒素動力分析儀 (Lipopolysaccharide Kinetic analyzer) : ELx808LBSS Plate Reader, Lonza., Switzerland.

(17). 倒立共軛焦顯微鏡 (Microscope) : LSM 780，Zeiss

(18). 鉺雅鉻雷射(Er:YAG Laser) : AdvErL Evo，Morita corporation

21

3.3 實驗流程圖

Fig. 3- 1 實驗流程圖如下所示

細胞試驗

螢 光 顯 微 鏡 H G F

細 胞 貼 附 數 量 細菌試驗

L A L

測 試

表

面 內 毒 素 殘 留 分 析

SY T O 9 / PI

細 菌 螢 光 分 析

鈦板接種牙周病菌形成生物膜

模擬臨床移除生物薄膜之處理

表面分析

接 觸 角 測 量 儀 表 面 親 疏 水 性 分 析

表 面 輪 廓 儀 表 面 粗 糙 度 分 析

SE M

表 面 結 構 分 析 模擬臨床移除生物薄膜之處理

控制組

(不接種

細菌)

接種 細菌

接種細菌 +0.12%

CHX 沖洗

接種細菌 +鈦刮匙

處理

接種細菌+

雷射滅菌

接種細菌+鈦 刮匙處理+雷 射滅菌處理

22

3.4 鈦金屬板之處理

3.4.1 鈦金屬板之處理

1. 鈦金屬板之研磨

使鈦板表面的粗糙度相同，以達到試片均一的目的。鈦金屬板之研磨委託邦杰材 料股份有限公司，粗糙度為Ra=1.3μm。

2. 鈦金屬板之清洗與滅菌

清除研磨加工過程殘留的雜質與落塵，並經由滅菌過程確保鈦板處於無菌狀 態。

【實驗步驟】

1. 將鈦板置於 50ml 離心管中，加入 10ml 丙酮。

2. 將離心管置於超音波震盪機中，以 40kHz、40W 進行超音波震盪 5 分鐘。

3. 將丙酮取出，加入 5ml 的二次水清洗一次後倒掉，再加入 10ml 的二次水進行 超音波震盪。

4. 重複上述步驟 2 次。

5. 將鈦板置於拭鏡紙上讓水分吸乾，並置入滅菌盒中。

6. 將鈦板滅菌 20 分鐘 (121℃，1.1atm)。

7. 將滅菌盒於無菌操作台中打開並開啟操作台風扇及 UV 燈，每 15 分鐘將鈦板 翻面一次進行風乾，重複三次共 60 分鐘。

3.5 細菌實驗

3.5.1 菌株特性、來源資料與培養保存方法

1. 菌株特性與來源資料

菌株及特性 來源

23

牙齦卟啉菌

Porphiromonas gingivalis

(革蘭氏陰性絕對厭氧桿菌)

ATCC^® 33277^TM

高雄醫學大學 牙醫學研究所

賴辰雄 教授

 菌種培養與保存方法

(1) 超低溫冷凍保存 (Ultra-freezing)

此方法用於菌株取得後保存菌種且不需立即進行實驗可長期保存菌種。

【實驗步驟】

1. 將甘油及蒸餾水以 1:4 的比例混合，配置成 100ml 或少於 100ml 的甘油溶液，

於滅菌釜中以 120℃, 20 分鐘滅菌備用。

2. 取已製備好的 20% (v/v)的甘油溶液和已培養至穩定期(stationary phase)的懸 浮菌液各取 500μl 裝入 1ml 冷凍小管中，儲存於-80℃冷凍櫃中。

(2) 繼代培養 (Subculturing)

實驗操作期間，定期解凍菌種重新活化後短期保存菌種之方式。

【實驗步驟】

1. 自冷凍庫中取出冷凍小管，置於室溫使其解凍後再以無菌操作方式打開瓶蓋，

取出菌液(10μl)接種至新鮮的培養液(10ml)中重新活化。

2. 培養 24 小時後使用接種棒沾取菌液以四區畫線法塗佈於固態培養皿上等待 菌落長出，檢查菌落有無汙染情形，無誤後將其保存於 4℃冰箱中並為實驗 期間使用之菌種。

3. 挑取上述固態培養皿上單一菌落，接種至 4ml 培養液中，並於厭氧培養缸中 加入厭氧產氣包進行培養。

24

4. 隔日取 100μl 接種於 5ml BHI broth 進行放大培養，此菌液則可用於實驗操作。

3.5.2 In vitro 植體周圍炎之模擬

透過將牙周病菌 P. gingivalis 接種在鈦板上模擬臨床植體遭到此種細菌感染時產 生的植體周圍炎。

【實驗步驟】

1. 將 P. gingivalis 菌液從-80℃冷凍櫃取出後，取出 30 μl 滴在血基培養皿上。

2. 將血基培養皿放入厭氧培養箱中五天，直到觀察到黑色菌落形成再取出。

3. 以酒精滅菌過後的採菌針刮菌，放入含有厭氧菌的培養液(BHI broth)的試管 中。

4. 並放入直立式的厭氧培養箱中培養 24 小時。

5. 取出測菌液 O.D.值，將其調製到 O.D.值為 0.1 6. 在每個 well 中加入 1ml 之 BHI broth 培養液。

7. 加入 O.D.值 0.1 的 P.gingivalis 菌液(300μl)，控制組則加入 300μl 培養液。

8. 將 24 孔盤放入厭氧培養箱中，放入厭氧產氣包後置於 37℃恆溫培養箱中培 養 72 小時。

25

Fig. 3- 2 in vitro 模擬植體周圍炎實驗流程

26

3.6 模擬臨床移除生物薄膜之處理 3.6.1 移除生物薄膜之處理

移除生物薄膜之流程及分組圖如下圖所示 :

Fig. 3- 3 移除生物薄膜之流程及分組圖

第一組(Group 1)：鈦板不接種細菌，浸泡細菌培養液，不接受清創處理。

第二組(Group 2)：鈦板接種細菌，但不接受清創處理。

第三組(Group 3)：鈦板接種細菌，以 0.12% chlorhexidine 沖洗清創。

第四組(Group 4)：鈦板接種細菌，以鈦金屬刮匙配合 PBS 沖洗清創。

第五組(Group 5)：鈦板接種細菌，以 Er:YAG 雷射照射配合無菌蒸餾水沖洗清創 第六組(Group 6)：鈦板接種細菌，先以鈦金屬刮匙再以 Er:YAG 雷射照射配合無 菌蒸餾水沖洗清創。

27

(1). 0.12% chlorhexidine 沖洗處理

【實驗步驟】

1. 將鈦板從 24well 中以滅菌過的鑷子取出。

2. 使用 10cc 空針抽取 0.12% chlorhexidine 沖洗鈦板，重複此步驟三次，共計使 用30cc 0.12% chlorhexidine。

(2). 鈦金處刮匙處理

【實驗步驟】

1. 將鈦板從24well 中以滅菌過的鑷子取出。

2. 將鈦金屬刮匙以約 45 度角由左向右的方向進行 debridement，每刮 10 次時 以 PBS 沖洗 5 次，每次 1ml，共刮 30 次。

3. 之後再將鈦板轉 90 度，重複上述 1 的步驟，確保鈦板表面都有被鈦金屬刮 匙 debridement 過。

(3). Er :YAG 雷射照射

【實驗步驟】

1. 將鈦板從24well 中以滅菌過的鑷子取出。

2. 將 Er : YAG 雷射的設定為 80 mJ 25PPS，使用 C600F(蕊心直徑 600μm)tip，

由左向右的方向進行 debridement，移動速度為 1mm/秒，打完鈦板約需 10 分 鐘。

28

3.7 細胞實驗

3.7.1 細胞解凍、培養、計數與保存方法

本實驗所使用的細胞株為 Human gingival fibroblast(HGF) cells。

(1). 細胞解凍

【實驗步驟】

1. 將細胞培養液放入 37℃水浴槽中加溫。

2. 將細胞從-80℃冰箱中取出，以水浴槽加熱使細胞回復常溫狀態。

3. 以電動吸取器(pipet-aid)取 10ml 細胞培養液到細胞培養皿中。

4. 將回溫的細胞加入培養皿中，左右搖晃使其分散均勻。

5. 在顯微鏡底下觀察細胞，確認細胞數量與細胞狀況，並放入 5% CO2，37℃

的恆溫培養箱中培養。

6. 培養 24 小時後吸除舊有的培養液，因當中含 DMSO 對細胞有毒害，再加入 新的細胞培養液進行培養。

(2). 繼代培養

【實驗步驟】

1. 將水浴槽開啟至 37℃，放入 PBS、培養液及 trypsin。

2. 吸除舊有的細胞培養液。

3. 沿著培養皿壁加入 5ml 的 PBS，沖洗舊有細胞。

4. 吸除沖洗之 PBS，加入 trypsin 1ml。

5. 輕拍培養皿，並搖晃使 trypsin 能均勻分布。

6. 放入 5% CO2，37℃恆溫培養箱中，約 5 分鐘後取出，再次輕拍培養皿，並 於顯微鏡底下觀察細胞是否飄起。

29

7. 加入 1ml 細胞培養液中止 trypsin 之反應。

8. 以 1000rpm 離心 5 分鐘，使細胞沉澱於底部，白色之沉澱即為細胞 pellet。

9. 吸掉上清液，加入新的細胞培養液 1ml，pipetting 打散細胞團塊。

10. 將上述細胞培養液加到含有 9ml 細胞培養液之培養皿中，放到 37℃、5% CO2

細胞恆溫培養箱中。

(3). 細胞計數

【實驗步驟】

1. 重複繼代培養步驟 1~9，取 100μl 的細胞液於 1.5ml 微量離心管中。

2. 加入 100μl 的 trypan blue 與細胞液混合。

3. 將蓋玻片蓋在血球計數器上，接著將細胞懸浮液充分混均勻，吸取 10μl 細

胞液，加入血球計數器及蓋玻片之間的空隙中。

4. 將血球計數器於顯微鏡底下計數，血球計數板中間細刻 9 個 1mm²大正方形，

其中四個角落之正方形再細刻為 16 個小格，深度均為 0.1mm，而每個大正 方形之體積為 1mm² 0.1mm。

5. 計算 4 個角落的大正方形內細胞數目，除以 4 再乘以 10⁴，即為每 1ml 中細 胞之數目。

(4). 冷凍保存

【實驗步驟】

1. 冷凍保存前先確定細胞是否有受到汙染。

2. 配置冷凍保存液 : 500μl DMSO + 新鮮培養液 9.5ml 至 15ml 離心管，固定 DMSO 濃度 5~10%。

3. 以 125xg 離心 10 分鐘將細胞上清液去除後，各取 5ml 含 DMSO 的冷凍保存 液在離心管內均勻沖散細胞。

30

4. 將細胞液各取 1ml 加到 2ml 無菌塑膠冷凍小管內，標明記號。

5. 冷凍管置於漸凍盒內，放在-80℃冰箱中長期保存，需要時再解凍。

3.7.2 免疫螢光染色及 HGF 細胞貼附鈦金屬板之定量分析

不 同 種 類 之 細 胞 膜 、 細 胞 質 或 細 胞 核 可 能 具 有 特 定 蛋 白 質 ( 例 如 : T lymphocyte 為 CD4⁺之細胞)，可以該特定蛋白質為該種類細胞之 marker，並以專 一性抗體結合配合呈色反應進行確認。本實驗使用可與 double strand DNA 結合 之 DAPI 為染劑標定細胞核，以及 ActinGreen™ 488 染劑標定細胞骨架以確認細 胞存在位置，並藉由倒立共軛焦螢光顯微鏡進行觀察。本實驗藉由觀察 HGF cell 在經不同處理後鈦板之貼附數量，尋找較為有效的治療方式。

【實驗步驟】

1. 將試片放入 24 孔盤中，細胞以 2.510⁴/well 的數量 seeding，分別培養 24、

72、120 小時，待時間點到後將舊有 medium 吸掉。

2. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。

3. 以 ice cold 4% paraformaldehyde 於室溫進行固定，時間為 10 分鐘。

4. 以 0.1% Triton-X100 在室溫下作用 10 分鐘。

5. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。

6. 加入含有 5% bovine serum albumin(BSA)的 PBS 在室溫下於 shaker 上以 100 rpm shaking overnight。

7. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。

8. 以ActinGreen™ 488 ReadyProbes™ Reagent 室溫下避光染色 30 分鐘。

9. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。

10. 以 DAPI 於室溫下避光染色 10 分鐘(1:1000 dilution, 10 ng/μl)。

11. 加入 PBS 並置於 shaker 上以 100 rpm 搖晃 wash 5 分鐘，並重複一次。

12. 將試片放在載玻片上加入 anti-fade mounting solution 30μl，並以蓋玻片蓋上，

避光保存。

31

13. 以共軛焦螢光顯微鏡觀察做細胞計數觀察紀錄每單位平方釐米的細胞數量 (cell number/mm²)。

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3.8 表面內毒素殘留分析 3.8.1 內毒素動力濁度法

Fig. 3- 4 內毒素動力濁度法實驗原理

【實驗步驟】

1. 試片經由不同移除生物薄膜之處理。

2. 將試片放入有 Certificate of Analysis (COA)認可 endotoxin-free 之 24 孔盤中。

3. 於 24 孔盤中加入 0.5ml 之去熱原水，於室溫下中以 100 rpm 搖晃 24 小時。

33

4. 將 100 μl 的 blank/標準濃度內毒素放入不含內毒素的玻璃管(endotoxin-free vial)s 中，其中 blank= LAL Reagent Water，將其震盪 30 秒。

5. 將每個玻璃管內及 24 孔盤中的試片加入 100 μl LAL 試劑與其反應，輕搖混 勻避免產生氣泡。

6. 放入 37°C±1°C 的培養箱中 10 分鐘。

7. 取出後加入100 μl 的 chromogenic substrate solution，輕搖混勻避免產生氣泡。

8. 再放入 37°C±1°C 的培養箱中 6 分鐘。

9. 加入500 μl Color-stabilizer #1 停止反應，輕搖混勻避免產生氣泡。

10. 加入 500 μl Color-stabilizer #2，輕搖混勻避免產生氣泡。

11. 加入 500 μl Color-stabilizer #3，輕搖混勻避免產生氣泡，此時可見明顯的桃 紅色溶液。

12. 建立標準曲線，已知濃度之內毒素，分別為:0.1、0.25、0.5 及 1 EU/ml，相 關係數須高於 0.98。

13. 從每個樣本中取 200μl，平均分配到 96 孔盤之 well 中接著將吸光值設定在 545nm，讀取溶液的數值。(利用 ddH2O 當作 blank，設定其吸光值為 0)。

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3.9 表面接觸角分析 3.9.1 表面接觸角分析

接觸角量測儀是量測液面在固體表面的附著程度，進而得知固體對於此液體 的親疏程度之表現。本接觸角量測儀採用液滴法(Sessile Drop Method)，可直接量 測介於液滴基線和液/固/氣─三相接觸點處的液/固─界面切線間的角度，與基材 表面所形成之夾角θ，此θ角度稱之為接觸角(contact angle)。其大小值可以楊氏 公式表示如圖 :

Fig. 3- 5 Schematic diagram of contact angle

γ

γ

γ

θ

cosθ=(γ

-γ

)/ γ

γ

=γ

+γ

cosθ

γ

為固體-氣體之表面張力

γ

為液體-氣體之表面張力

γ

為固體-液體之表面 張力

Solid

Liquid

Vapour

35

【實驗步驟】

1. 在開機後先以標準校正球進行 Measured distance 校正。

2. 於動態影像畫面，於 tip 中將液滴擠出至快破張力時擷取畫面。

3. 接著點選 IF Tension 量測表面張力，並到 Calibraion 介面中輸入 Measured IFT 進行校正。

4. 將試片放在載台，調整直到畫面中出現試片。

5. 將水滴擠出，並以水性麥克筆畫螢幕上 tip 之下緣以及水滴之下緣以便固水

滴之體積。

6. 將 tip 向下移動使之沾到試片表面。

7. 待水滴不再攤平的時候以三點定圓量測法進行接觸角測量，並記錄數據。樣

本數為 3 (n=3)。

36

3.10 表面粗糙度分析 3.10.1 表面粗糙度分析

為分析生物薄膜、0.12 % chlorhexidine、鈦金屬刮匙及 Er：YAG laser 對於表面粗 糙度之影響，本實驗使用儀器為表面輪廓儀(Microfigure measuring instrument)，

使用參數為 : cutoff = 0.8，E.length = cut off  5。測量之參數為 Ra、Rq 及 Rz。

其定義為 :

Ra(中心線平均粗糙度) :

Rq(平方平均值粗糙度) :

Rz(十點平均粗糙度) :

【實驗步驟】

1. 將試片放置到鏡頭底下，仔細調整以對準探針。

2. 調整鏡頭直到照到試片的表面，此時下針的位置會位於螢幕正中央。

3. 使探針往下移動，並注意下針點是否有脫離試片。

4. 待探針就定位時按下 measurement 進行測量，並記錄數據，每個試片隨機取 6 個點進行分析以代表母群體。樣本數為 3 (n=3)。

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Fig. 3- 6 粗糙儀測量鈦板表面粗糙度之示意圖

Surfcorder ET200

Auto

38

第四章 實驗結果

4.1 SEM 觀察不同清創處理後之鈦板表面

下圖Fig.4-1 為使用 SEM 所觀察到的粗糙鈦金屬表面(a)為放大 5000X (a´)為放大 10000X 的 control 組，並沒有任何細菌出現在其表面。Fig.4-2(b)為 P. gingivalis 形成在鈦金屬表面上的情形，從放大10000X 的(b´)所示，可以看見 P. gingivalis 的大小為2~3µm，在三天的培養中有明顯的 Biofilm 形成

Fig. 4- 1 SEM images of (a) Group 1 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (a´) Group 1 of P.gingivalis, magnification 10000 X

Fig. 4- 2 SEM images of (b) Group 2 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (b´) Group 2 of P.gingivalis, magnification 10000 X

Group 1 (a) (a

´

(b

´

39

Fig.4-3(c)為使用 0.12% chlorhexidine 沖洗後的結果，可以看見在粗糙的鈦板表面 仍有P. gingivalis 群聚在上方，從放大 10000X 的 (c´)所示，可以發現在一些死角 的位置，仍然有許多群聚的P. gingivalis 無法被清除。Fig.4-4(d)為使用鈦金屬刮

匙加上 PBS 沖洗後的結果，可以看見與(a)圖相比，原本乾淨的表面出現了包埋

著細菌殘餘的鈦金屬碎屑，從放大10000X 的(d´)所示，仍有群聚的細胞在表面，

表示使用鈦金屬刮匙無法清除清除所有的細菌。

Fig. 4- 3 SEM images of (c) Group 3 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (c´) Group 3 of P.gingivalis, magnification 10000 X

Fig. 4- 4 SEM images of (d) Group 4 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (d´) Group 4 of P.gingivalis, magnification 10000 X

(c

´

(d

´

Group 4 (d)

40

Fig.4-5(e)為使用 Er:YAG laser 清創的結果，可以看見粗糙的鈦板表面幾乎沒有 P.

gingivalis 群聚在上方，從放大 10000X 的(e´)所示，可以發現其表面最為接近 (a´)control 組的表面。(f)為先使用鈦金屬刮匙再加上 Er:YAG laser 清創後的結果，

可以看見幾乎沒有P. gingivalis 群聚在上方。從放大 10000X 的(f´)所示，原本的 鈦金屬表面出現被鈦金屬刮匙使用後的水平及垂直方向的痕跡，鈦板表面型態有 變化。

Fig. 4- 5 SEM images of (e) Group 5 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (e´) Group 5 of P.gingivalis, magnification 10000 X

Fig. 4- 6 SEM images of (f) Group 6 of P.gingivalis, magnification 5000 X ; (f´) Group 6 of P.gingivalis, magnification 10000 X

(e

´

(f

´

Group 6 (f)

41

4.2 共軛焦顯微鏡觀察清創處理後鈦板表面活菌死菌分佈情 形

SYTO 9 Propidium iodide Merge

Fig. 4- 7 Representative fluorescence images(63X) with live(green)/dead(red) stain of P. gingivalis ATCC 33277 adhesion on rough titanium discs surface after different treatment. Panel (a): Group 1. control ; Panel (b): Group 2. P. gingivalis; Panel (c):

Group 3. 0.12% CHX.

Group 1 (a)

Group 2 (b)

Group 3 (c)

42

SYTO 9 Propidium iodide Merge

Fig. 4- 8 Representative fluorescence images(63X) with live(green)/dead(red) stain of P. gingivalis ATCC 33277 adhesion on rough titanium discs surface after different treatment. Panel (d): Group 4. Ti curette ; Panel (e): Group 5. Laser; Panel (f): Group 6. Ti curette + laser.

Group 4 (d)

Group 5 (e)

Group 6 (f)