樣品回收率

取樣品三份，分別加 3.3.1.1. 配製之短鏈脂肪酸標準品混合 溶液，使添加為適合濃度。依 3.3.3. 所述樣品前處理方法，

進行 3.3.4.之氣相層析分析及 3.3.5.建立之最適毛細管區帶電 泳分析，分別測試回收率。

肆、 結果與討論

本論文使用毛細管電泳中最簡單的操作模式，即毛細管區帶電泳 (capillary zone electrophoresis, CZE)建立最適化之短鏈脂肪酸(SCFAs) 分析條件。CZE 只須將毛細管中充滿電解液，外加電場後，帶正、負電 荷之分析物便依照其帶電量和質量比值的差異，產生不同之遷移速率而 達到分離的效果。CZE 分析短鏈脂肪酸(SCFAs)的最適條件確認，將藉 由檢視電解液中個別成分或其特性改變對分析物分離的影響程度，經逐 步修正來達成，包括：濃度、pH 值及電壓等等條件。首先要確認的是 背景電解質與偵測波長之選用，以期具有優良分離和檢測能力，其次為 檢視令電滲流反轉之電滲流修飾劑濃度，以達到 SCFAs 陰離子與電滲 流同向遷移而縮短分析時間。接著是調整電解液 pH 值，以控制 SCFAs 解離差異獲得最佳解析度。最後是變化電解質濃度及操作電壓大小來調 整電滲流速度，以達成最佳分析效率。另一方面，為印證本論文開發之 CZE 分法的可靠性，將透過以氣相層析法(Zhao et al., 2006)分析實際樣 品中 SCFAs 的結果比對確認。

4.1、毛細管區帶電泳最適化條件建立

4.1.1 檢測方法的選擇

毛細管電泳分析 SCFAs 時，由於其分離效率高、自動化程度優及 使用化學藥劑量少等等優點，使它極具發展潛力。然而利用毛細管電 泳分析 SCFAs 預期將會遭遇到檢測上的困難，問題主要是來自於此等 分析物缺乏有效之發色團結構，因此將無法以普遍性高之直接線上 (on-line)吸收法來偵測，必需要預先衍生化處理或者是使用其他的偵 測方式加以克服。

毛細管電泳分析 SCFAs 的操作模式可有微胞電動毛細管層析 有機酸。例如 Arellano 等學者(2000)應用間接吸收法分析厭氧菌培養 液中的 SCFAs：以 10 mM 苯甲酸 和 10 mM 組氨酸(histidine)為背景 電 解 質 ， 1 mM 十 四 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 (tetradecyltrimethylammoniumbromid, TTAB)為電滲流修飾劑，在波長 220nm 下測得了培養液中 11 種小分子的有機酸。此外，尚有間接的 螢光檢測應用，如 Desbène 等學者(1995)則用螢光素鈉鹽(fluorescein sodium salt)為背景信號發光劑，5 mM 硼酸鈉和乙醇(V/V, 60:40)或用 5 mM 硼酸鈉(含 0.2 mM hexaethylene glycol mono-n-dodecyl ether)作 為 電 解 質 ， 利 用 雷 射 誘 導 間 接 螢 光 偵 測 法 (laser-induced indirect

4.1.2 背景電解質與最適偵測波長選擇

毛細管電泳間接偵測之背景電解質的選擇條件，除了高吸收特性 外，還必須具備另一要件，即與分析物離子有相近的遷移率，以確保 峰形對稱和足夠的檢測靈敏度(Doble et al., 2000)。本研究以間接吸收 偵測的方法分析 SCFAs，首要步驟便是選擇適當的背景電解質。Wu 等學者(1995)的有機酸間接偵測研究結果顯示，常用背景電解質以 phthalate 和 benzoate 的相對遷移率與乙酸較相近，其關係為 phathlate

> acetate > benzoate。然而可預期，遷移率比乙酸慢的 benzoate 應該比 phthalate 更合適於分析 SCFAs，因為乙酸的分子量是本論文分析目標 之短鏈脂肪酸 (乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸) 中最小，在 pka 相近(表 4-2)下，其他短鏈脂肪酸的電荷質量比更小，其相對遷移率將 都比乙酸慢。因此，整體短鏈脂肪酸的遷移率範圍將和 benzoate 更契 合。Klampfl 等學者(2000)對 CE 分析食品中低分子量有機酸的文獻回 顧中指出，苯甲酸常用於麵包中丙酸檢測的背景電解質。再者，Foret 等學者(1989)使用苯甲酸與三硝基甲苯成功分離了小分子的無機陰離 子和羧酸；相同的電解液也被用於麵包中丙酸的測定(Ackermans et al., 1992)。Mallet 等學者(1999)使用苯甲酸和組氨酸的混合液測定酒中的 酒石酸含量。另外 Ehala 等學者(2001)則應用苯甲酸偵測牛奶發酵過 程中產生的有機酸。

綜合上述相關文獻(表 4.1)，可知苯甲酸相當適合於分析低分子量 有機酸，是以本論文決定選用苯甲酸作為分析 SCFAs 之背景電解質。

偵測波長方面，當然以苯甲酸之紫外光最大吸收波長(圖 4.1)為依據，

而相關文獻，如 Ehala 等學者(2001)以苯甲酸作為背景電解質分析有 機酸成分時，亦是使用相似之偵測波長，因此選擇 226 nm 作為偵測 波長。

4.1.3

SCFAs 遷移時間隨電解質 pH 值增加(9.5–11.5)而縮減。此一現象明顯 是受到 EOF 速率因 pH 增加而加快的影響，雖然高 pH 值帶來時間效

遷移，但因電滲流的流速較大，會趨使此等陰離子最終往負極方向移 動，相較於陽離子及中性離子，其淨遷移速率最慢，明顯不利於分析 效率。為改善此缺點，將藉由添加電滲流修飾劑來改變毛細管內壁電 荷特性，使電滲流之流向反轉，形成電滲流和陰離子同向移動，即短 鏈脂肪酸陰離子具有最快的遷移速率，亦即最短遷移時間，以達到提 升其分析速度目的。

在電解液中加入陽離子介面活性劑 CTAB 可使電滲流反轉而朝正 極方向前進(Quirino and Terabel, 2000)，而 Ehala 等學者(2001)、Souza 等學者(1998)、Levart 等學者(2000)、Fu 等學者(1998)，已成功地將 CTAB 運用在各式樣品的有機酸分析，本實驗因此選用 CTAB 作為電 滲流修飾劑。

實驗結果顯示(圖 4.3)：在 pH 11.0 之 20 mM 苯甲酸電解緩衝溶 液中，當 CTAB 添加濃度達 0.5 mM 之後，便足夠完全使電滲流反轉，

且 SCFAs 的遷移速度不再明顯變化。而此結果和 Levart 等學者 (2000)、胡等學者(2009)相符。因此，選擇添加 0.5 mM CTAB，作為 往後實驗之電解緩衝液基本組成，以便達成縮減短鏈脂肪酸陰離子遷 移時間之目標。

4.1.5

外加電壓與毛細管長度的比值即是電場強度。電場強度主要是影 響遷移時間的快慢，但不會改變分離選擇性。較長的毛細管柱雖可提 升理論板數，但因外加電壓有其限制(通常是 30kV)，則反而降低電場 強度，並增加遷移時間，因此經驗上以 100cm 為其極限，所以在探討 外加電壓對遷移時間的實驗中，固定毛細管的長度 100cm（有效長度

速電滲流，縮短遷移時間，但無可避免地，高電壓引發的焦耳熱將導 致雜訊增加使解析度降低。

圖 4.4 為不同操作電壓對短鏈脂肪酸分離的影響。隨著電壓增加 (15–30kV，受儀器限制，30kV 是為上限)，短鏈脂肪酸遷移時間迅速 縮減，但當電壓超過 -20 kV，短鏈脂肪酸便因遷移速度過快而無法完 全彼此分離，同時電泳圖基線的雜訊亦為之明顯增大，導致短鏈脂肪 酸的解析效能不足。考慮遷移時間和解析度的平衡，因此選擇 -20 kV 作為短鏈脂肪酸分析之最適操作電壓。實驗使用負電壓是因為電滲流 反轉，故必須電極交換，使陰離子分析物能率先流向檢測器端(陰極) 以便順利偵測。

4.1.6

本論文使用苯甲酸作為間接吸收法之背景電解質，以同時偵測六 種短鏈脂肪酸。苯甲酸對短鏈脂肪酸遷移時間的影響如圖 4.5 所示：

當苯甲酸濃度在 5–50 mM 之間，短鏈脂肪酸之遷移時間隨苯甲酸濃 度增加而延長。此結果可由電雙層理論(Agilent Techologies, 2000)說 明：當緩衝溶液的離子強度增加，亦即苯甲酸濃度增加，會造成 zeta 電位下降，進而導致電滲流速率降低，使分析物遷移時間增長。

另一方面，圖 4.6 則顯示苯甲酸濃度對短鏈脂肪酸之積分面積的 影響結果。短鏈脂肪酸之積分面積隨苯甲酸濃度增加(5–15 mM) 而增 加，然而當濃度大於 20 mM 之後，積分面積的增加已趨於平緩，其 應可歸因於電解質濃度增加，熱功效應增加基線雜訊所致。為增加短 鏈脂肪酸的偵測極限，實驗因此選擇 15 mM 苯甲酸 作為 CZE 分析 最適背景電解質濃度。

4.2 最適分離條件的確認 之 acetic、propionic、butyric、i-butyric、valeric、2-ethylbutyrate 等標 準品之混合溶液，在 CZE 最適條件下進行六重複分析，並由標準品

到電泳動的大小，造成每次分析時的遷移時間差異，結果導致波鋒面 積隨之變異。

4.2.2 檢量線(calibration curve)

在確定最適分析條件後，依據 Beer’s Law，由偵測不同濃度之 SCFAs 標準品吸收值與積分面積，可建立檢量線，用於樣品定量 SCFAs。為同時定量多種 SCFAs，並消除 CZE 微量進樣體積引進之不 準 度 ， SCFAs 檢 量 曲 線 製 作 採 內 標 準 品 檢 量 法 (internal standard method)，分別取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸等標準品及內標準 品(internal standard)：2-乙基丁酸，配製一系列濃度進行分析，並由濃 度與波峰面積作圖及線性廻歸。檢量線之良囿則由定量極限(limit of quantification, LOQ)、線性範圍(linear range)、確定係數(coefficient of determination, r²)等評估。由於當濃度超過 3 mM 時，波形扭曲且遷移 時間也因為濃度增加而往後拖長，因此定量曲線只做到 3mM。

由 表 4.5 可 以 看 出 ： SCFAs 的 檢 量 線 定 量 極 限 為 0.01 mM(i-butyrate)與 0.05 mM(acetate, propionate, n-butyrate, valerate)，線 性範圍 0.01 mM －3.0 mM 之間，確定係數(R²)介於 0.9987 (n-butyrate) 到 0.9999 (valerate)之間。與過去的文獻(表 4.6)比較，顯示本研究之 SCFAs 定量方法效果良好。

4.2.3 偵測極限(detection limit)

偵測極限以信噪比( S/N) = 3 來定義。SCFAs 之偵測極限結果如表 4.7 所示：乙酸 10.0M、丙酸 7.5M、丁酸 7.5M、異丁酸 5M、

戊酸 10M。相較於表 4.6 中，運用高效液相層析、氣相層析與毛細 管電泳等相關研究文獻分析 SCFAs 所列之不同單位的偵測極限，本研

究開發的毛細管電泳法具有相同水準的表現，由其雖是間接偵測，但 效果已和直接偵測相當。

4.3 實際樣品分析並與 GC 分析方法驗證

確立此 CZE-UV 最適條件的有效性後，本研究之 CZE-UV 方法則 再繼續和 Zhao 等(2006)之 GC-FID 方法針對實際樣品：食麋、乳製品 等進行同步分析，以驗證本 CZE-UV 方法之實用性。對於樣品的前處 理，分別參考相關文獻(Garcia et al. 2008; Zhao et al. 2006; Innocente et al. 2000)。由於作為對照用的 Zhao et al. 2006 發表之 GC-FID 方法使 用特殊管柱，樣品可免去繁雜的衍生化，因此在樣品前處理上，

CZE-UV 和 GC-FID 兩者方法是相同。

4.3.1 食麋

本實驗中所使用的食麋是分別取自不同豬隻的結腸，取出後冷凍 儲藏待實驗分析使用。進行分析之前，食麋樣品經前處理再經適當倍 數稀釋後以 0.22 µm 濾膜過濾，之後分別以本實驗開發出的 CZE 條 件進行分析並與氣相層析法(Zhao et al., 2006)進行比較。圖 4.8 即是分

本實驗中所使用的食麋是分別取自不同豬隻的結腸，取出後冷凍 儲藏待實驗分析使用。進行分析之前，食麋樣品經前處理再經適當倍 數稀釋後以 0.22 µm 濾膜過濾，之後分別以本實驗開發出的 CZE 條 件進行分析並與氣相層析法(Zhao et al., 2006)進行比較。圖 4.8 即是分