血清/血漿

除蒸餾、萃取或超濾純化等步驟外，去除蛋白質是血清/血漿樣品純化 的另一重要步驟。

2.2.2.1

去蛋白質

常見去蛋白質方法有三種，分別是：

(1) 添加酸沉澱劑：過氯酸是最常用的酸沉澱劑，蛋白質去 除較完全但會造成檢測樣品的 pH 值過低，導致儀器損傷，如果 加鹼中和樣品溶液又會導致濃度稀釋。其他的酸沉澱劑有三氯乙 酸和磺基水楊酸。使用酸沉澱法的關鍵是沉澱劑及其用量的選 擇，其缺點是沉澱物的吸附會損失分析物。

(2) 使用有機溶劑：此法可以克服酸沉澱法的缺點，因為它 可從變性的蛋白質上較好地萃取出分析物。常用的有機溶劑有乙 腈、異丙醇、甲醇等。

(3) 超濾法：採用可阻擋相對分子量 10000–50000 Da 的濾膜 在約 7000 r/min 的離心力或 2–4 Pa 的壓力下能除去樣品中的蛋白

質。該方法去蛋白質迅速簡單而且所需樣品量少、成分變化少。

與酸沉澱法比較，超濾法的優點是條件溫和、不易帶來雜質，但 缺點是濾膜會吸附部分有機酸。

通常樣品經去蛋白質後可直接進入分析系統分析，但有時也 需再進一步處理，如蒸餾、萃取、衍生化等。

2.2.2.2

血清/血漿的蒸餾和萃取 2.3 SCFAs 的分析方法

血清/血漿蒸餾法常用於 SCFAs 之氣相層析分析法的前處理，主要缺點 是樣品中含乙醯基成分的熱解會引起乙酸值增高。

液-液萃取法也是血清/血漿樣品前處理常用的方法，一般使用多種有機 溶劑或其混合物作為有機酸的萃取劑，如醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、

乙酸乙酯、醇等。最典型的溶劑為氯仿和甲醇，如經典的 Folch 法，甲醇是 混合溶劑中必要的組成部分，它作為蛋白沉澱劑可將血清蛋白中的脂肪酸 釋放出來。Folch 法經過許多改良已被廣泛使用，但是該法回收率較低。

SPME 技術亦廣用於血清/血漿樣品中 SCFA 的提取。Moreau (2004)等用不 同類型的萃取頭萃取去蛋白質後的血漿上清液中的 SCFAs，結果發現 CAR /PDMS 的萃取率最高，CW /DVB 和 PDMS/DVB 萃取率較差，而 PDMS 和 PA 無效。SPME 的優點已使其發展成為血清/血漿中萃取 SCFAs 的一種簡 單、方便、有效的方法。

2.3.1

氣相層析(gas chromatography, GC)

SCFAs 最廣泛的分析方法是配備火焰離子化檢測器(flame ionization detector, FID)的 GC。生物樣品中 SCFAs 的含量一般較低，以 GC-FID 之靈 敏度而言，要準確定量 SCFAs 並不困難，但因進行 GC 分析所需之衍生化 處理容易使樣品中高揮發性 SCFAs 損失，且再現性不佳，所以應盡可能於 低溫下進行。Ghoos 等(1991)用第三丁基二甲基矽烷(tert-butyldimethylsilyl) 衍生糞便中的 8 種 1C–6C 直鏈和支鏈脂肪酸，配合質譜儀偵測，偵測極限 為 0.126 mmol/L，回收率 90%。使用有機酸分析專用之 GC 管柱，可省略 衍生化處理，但會有 SCFAs 在管柱中殘留的問題，導致連續進樣分析過程 中，因吸附的酸不定時釋出而出現鬼峰，降低精確度和準確度，現行的解 決方法是管柱定期注入甲酸，以沖洗殘留在管柱中之 SCFAs(Zhao et al., 2006)。

2.3.2.

高效液相層析(high performance liquid chromatography， HPLC) HPLC 測定脂肪酸最主要的難題是：脂肪酸分子結構中缺乏有效之可見 -紫外光吸收或是螢光的基團，雖然可藉由改用電化學偵測器而免除衍生化 前處理而可直接偵測，但卻有高成本且再現性不佳的困擾。因此，HPLC 分 析脂肪酸，仍以衍生化處理後再用光學儀器偵測為主流，如 You 等學者 (2001) ， 以 螢 光 劑 9-(2-hydroxyethyl)-carbazole 和 脂 肪 酸 在 偶 和 劑 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide 以 及 鹼 性 催 化 劑 4-dimethylaminopyridine 的存在下反應生成穩定產物，之後以乙腈稀釋便可

直接進入 HPLC 檢測，此法可同時分析 1C–20C 脂肪酸，其中 SCFAs 滯留 時間是在 8–15 min 。另外，也有不經衍生化而直接測定者，如 Horspool 等學者(1991)先經 C18 固相萃取，支後以離子交換管柱分離馬盲腸液中的 7 種 SCFAs，並在波長 210nm 下直接檢測。

2.3.3

毛細管電泳(capillary electrophoresis， CE)

在目前的研究中，有機酸的毛細管電泳分析多採用毛細管區帶電泳 (CZE)的模式。如同 HPLC，由於脂肪酸缺乏有效之紫外光或螢光發色基團，

直接偵測必須先經衍生化處理以提高靈敏度，如 Kibler 和 Bachmann(1999) 以 4-aminofluorescein 加上 dicyclohexylcarbodiimide 試劑進行有機酸之螢光 衍 生 化 反 應 ， 再 使 用 毛 細 管 電 泳 雷 射 誘 導 螢 光 偵 測 方 法 (capillary electrophoresis-laser-induced fluorescence, CE-LIF)檢測 5C–9C 的有機酸。

Santa 等學者(2002)認為：具有苯并呋喃(benzofuran)結構的試劑是一系列很 好的羧酸螢光衍生化試劑，相較於聚亞甲基的試劑，它們的分子結構小，

反應更容易，如：

4-N-(4-N-aminoethyl)piperazino-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-PZ-NH2);

7-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-4-N-(4-N-aminoethyl)

piperazino-2,1,3-benzoxadiazole; 2-(7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonamido) ethanesulfonic acid) 等 。 因 此 ， Santa 等 學 者 (2002) 使 用 (NBD-PZ-NH2)為衍生試劑，運用 CE-LIF 偵測出 4C-20C 的脂肪酸，而 Uchiyama 等 (2001)則以 4-mercapto-7-methylthio-2,1,3-benzoxadiazole 為螢

光衍生試劑，檢測五種羧酸。

另一種解決方案是採用間接偵測法，此法的優點是可以免除既冗長又 不易掌控的樣品衍生化前處理。間接偵測法的關鍵技巧是在電解質溶液中 加入稱為背景電解質(background electrolyte) 的強烈紫外光吸收物質，以大 幅提高紫外光吸收檢測時電解質溶液的基線(baseline)背景值。因而當極細 毛細管中不具有或僅有弱紫外吸收的分析物質通過檢測器時，將明顯降低 背景檢測值而出現倒峰，但其檢測靈敏度則小於直接偵測。Doble 等學者 (2000)指出，間接偵測法之分析靈敏度明顯和所選用的背景電解質有關，當 背景電解質和檢測物之間的吸光能力差異越大，則檢測靈敏度越高。在低 分子量的有機酸偵測中，常見的背景電解質有：

(1) 鉻酸鹽類(chromate)：結合 EOF 修飾劑 anion-BT®， Jones 和 Jandik(1991) 成功應用 chromate 分離多種羧酸，此系統亦可應用於血清(Oefner, 1995)、植物(Trevaskis and Trenerry, 1996)中有機酸的測定。Horie 等 (1998)則改用 TTAB (tetradecyltrimethylammonium bromide)作為 EOF 修 飾劑，應用於茶中的有機酸分析。

(2) 苯甲酸及其衍生物：Foret 等(1989)在苯甲酸鹽緩衝液中加入三硝基甲 苯，成功分離出小分子的無機陽離子和羧酸。相同的電解液體系也引 用於麵包中丙酸的测定(Ackermans et al., 1992)。苯甲酸衍生物，如鄰 苯二甲酸根(phthalate)也常被應用，當配合 TTAB 可應用於分析植物

(Wang et al., 2003；Li et al., 2003)以及土壤(Li et al., 2003)中的有機酸，

而 結 合 anion-BT® 則 應 用 於 分 析 菸 草 中 的 有 機 酸 (Lagoutte et al., 1994)。另一種苯甲酸衍生物 trimellitate 則被應用於测定果汁、茶等飲 料中的九種有機酸(Wu et al., 1995)，以及多種環境樣品之有機酸分析 (Westergaard et al. 1998； Hagberg et al., 2000)。

(3) 2,6-吡啶二羧酸(2,6-pyridinedicarboxylic acid, PDC)：此種背景電解經常 應用在食品(Soga and Motohiro, 2001)及環境樣品(Levart et al. 2000)之 有機酸分析。Soga and Ross(1997, 1999)使用 cetyltrimethylammonium hydroxide (CTAH)可同時分離無機陰離子、有機酸、氨基酸和糖類化合 物。由於 PDC 能與金屬離子形成錯合物，因此也能用於金屬陽離子、

無機陰離子和有機酸的同時分離測定(Soga and Ross, 1999)。

除以上所敘述外，尚有多種背景電解質，例如 octanesulfonic acid (Klampfl, 1999)、naphthalenesulfonates(Shamsi and Danieison, 1994)也都可運 用在有機酸的 CZE 偵測。

2.4 毛細管電泳簡介

2.4.1

毛細管電泳原理

毛細管電泳是以內徑 10–100 μm 的極細熔融矽(narrow-bore fused-silica) 毛細管作為分離靜相管柱，外加高壓直流電場作為動相驅動力，樣品中各 分析成分則因遷移速度和分佈行為上的差異而達成分離的一種分析技術。

2.4.1.1

遷移(migration)

毛細管電泳的基本分離機制來自樣品中各分析成分的遷移速度差異。

事實上，在高壓電場作用下，帶電粒子在毛細管內緩衝溶液(電解質)中的遷 移速度等於電泳動(electrophoretic mobility， EPM)和電滲流(electro-osmotic flow， EOF)速度的向量和。

EOF

app  

  ₀

0：帶電粒子受電場影響而移動的過程，稱為電泳動，它和分析物性質 有關。通常電荷數愈多、體積愈小則電泳速率愈快，而電性則關係 到遷移方向。

EOF：是因熔矽毛細管內壁的負電荷引發電雙層而產生的電滲流速度，

和電場強度、緩衝溶液 pH 值等有關。

2.4.1.2

電滲流(electroosmotic flow， EOF)

電滲流為毛細管電泳進行分離的重要驅動力。它是來自於毛細管電泳 所用的熔矽毛細管柱，因內徑極細，為 10–100 μm，在 pH > 3 的情況下，

其內壁表面的矽醇基(Si-OH)解離而帶負電(圖 2.4)，此時電解液中的帶正電 離子會受到此負電荷表面的吸引，而堆積在毛細管內壁表面形成電雙層 (electric double layer)，在外加電場之作用下，電雙層外圍之水合正電荷離子 (即陽離子)受負極吸引而移動，進而帶動毛細管內的水溶液整體朝向負極流 動，此一吸引作用而產生的流動現象稱之為電滲流(圖 2.5)。由於毛細管的

管徑極細小、散熱很快，即便是較高的電場和溫度，也不致如一般凝膠電 泳那樣因膠體變性而影響解析度。

圖 2.4 毛細管內壁矽醇基解離(-SiOH)示意圖

Figure 2.4 Representation of the silanol groups at the capillary wall

(陳， 2003)

圖 2.5 電滲流的產生 (a)管壁因矽醇基解離而帶負電荷 (b)水合陽離子吸 附在管壁上 (c)高電場作用下，水合陽離子受電極吸引並帶動水溶液朝負極 移動 (d)影響電滲流速率的因子為電解液的 pH 值、離子強度、介電常數 Figure 2.5 Development of the electroosmotic flow. (a) negatively charged fused silica surface(Si-O-) (b) hydrated cations accumulating near surface (c) when a voltage is applied to the system, the counter ions and associated water molecules migrate toward the cathode (d) the rate of EOF is dependent on factors that affect the double layer of charged groups, such as the pH, ionic strength and dielectric constant of the medium

(Kuhn and Hoffstetter-Kuhn, 1993) a.

b.

c.

d.

5

電滲流的速率隨 pH 值變化有明顯的滯後現象(hysteresis)產生，也就是緩衝 溶液的 pH 值在增高或降低過程對電滲流速率的影響並不一致。

Figure 2.6 Electroosmotic flow hysteresis for cycle of pH

(Frazier et al., 2000)

2.4.2

毛細管電泳的裝置

毛細管電泳儀器裝置的基本組成如圖 2.7 所示。包含毛細管、一對緩衝

溶液瓶、高壓電源供應器、偵測系統以及數據處理系統。操作時樣品由毛 細管一端注入，後將毛細管兩端分別置於緩衝溶液中，再藉由電極將 1–30 kV 直流電導入緩衝溶液形成外加電場，以進行分離(Landers, 1997)。

2.4.2.1

進樣方式

毛細管電泳的進樣方式可分為兩種((Landers, 1997) :

( 1 ) 電動進樣( electrokinetic injection )

電動進樣是將分析樣品置於毛細管進樣端，施加高電壓一段 時間使分析物因本身電泳動與電滲流而進入毛細管。此種方式會 受到分析物自身所帶電荷程度的影響；分析物若帶電荷過大有可 能極易或極不易進入毛細管內。

圖 2.7 毛細管電泳系統基本組成

Figure 2.7 Basic components of a CE system

(Frazier et al., 2000)

( 2 ) 流動進樣 ( hydrodynamic injection )

流動進樣可分為壓力進樣、真空進樣與重力進樣。壓力進樣 與真空進樣類似，只是施加壓力的位置不同。壓力進樣是在毛細 管進樣端外加氣壓，真空進樣是在出口端抽真空將高壓端樣品吸 入管內。重力進樣是將分析物抬高 5–10 cm 數秒，利用虹吸效應

流動進樣可分為壓力進樣、真空進樣與重力進樣。壓力進樣 與真空進樣類似，只是施加壓力的位置不同。壓力進樣是在毛細 管進樣端外加氣壓，真空進樣是在出口端抽真空將高壓端樣品吸 入管內。重力進樣是將分析物抬高 5–10 cm 數秒，利用虹吸效應

在文檔中 以毛細管區帶電泳分析短鏈脂肪酸 Determination of short chain fatty acid by (頁 27-0)