同 步 定 量 PCR 使 用 的 TBP 螢 光 探 針 為 Hs 00920494_m1
（ TaqMan, Applied Biosystems ）， HSPB1 螢 光 探 針 為 Hs 00356629_g1（TaqMan, Applied Biosystems），且皆使用 HuHPRT 螢 光探針（4326321E, Applied Biosystems）當內生性對照組。反應溶液 總體積為 25 μl，包含 25 或 50 ng cDNA、1 × mix solution（2 × TaqMan Universal PCR Master mix - 20 × Primer/Probe mixture）。反應 以 ABI PRISM 7000 Sequence Detectin System 儀器進行，條件設定為 50℃ 2 分鐘，再 95℃ 10 分鐘裂解雙股 cDNA，接著以循環式的裂
解溫度 95℃ 15 秒，60℃ 60 秒，進行 40 個循環作用後，以 ABI 前述 Goat anti-GRP-78、Goat anti-HSC70、Goat anti-HSPB1、Mouse anti-β actin 外，另使用 Rabbit anti-GFP （BD）稀釋 400 倍與 Mouse anti-1C2 （Chemicon）稀釋 10000 倍進行檢測 tNTBP-Q3/54-EGFP 的 融合蛋白分子量的正確性與表現情形（1C2 為辨識擴增聚麩醯胺鏈 的專一性抗體）。使用之二級抗體除上述之 HRP conjugated donkey anti-goat IgG （H&L）與 goat anti-mouse IgG （H&L）外，尚包含稀 釋 2000 倍之 alkaline phosphatase （AP） conjugated goat anti-rabbit IgG （H&L）（Zymed）與 goat anti-mouse IgG （H&L）（Zymed）。
上述蛋白質萃取實驗重複進行兩次，每次萃取的蛋白液重複兩次西方 轉漬分析。最後將四次呈色結果利用 AlphaImager 軟體進行定量分 析。
（七）次細胞蛋白質分群（Subcellular protein fractionation）分析
利用 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Cat.
No. 78833, Pierce）進行次細胞蛋白質分離及製備，其方法如下：離 心 500 g、4℃ 3 分鐘，收集誘導 2 天的誘導式 SCA17 細胞（20 µl 體積），加入 200 µl 含有蛋白酶抑制劑（protease inhibitors）之 CER I，震盪 15 秒，使細胞完全懸浮，置於冰上作用 10 分鐘。再加入 11 µl CER II，震盪 5 秒，冰上作用 1 分鐘後，再次震盪 5 秒，取 30 µl 溶液當總蛋白質萃取液（total protein extract）。離心 16,000 g、4
℃ 5 分鐘，取出上清液即細胞質蛋白萃取液（cytoplasmic extract）。
底層不溶解物質，加入 100 µl NER，進行震盪 15 秒，冰上作用 10 分鐘，重複四次共 40 分鐘，使其完全溶解。離心 16,000 g、4℃ 10 分鐘，取出上清液即核蛋白萃取液（nuclear extract）。總蛋白質經定 量後，取相同體積之總蛋白質、細胞質蛋白與核蛋白萃取液，進行西 方轉漬蛋白質分析。使用一級抗體包含：稀釋 2000 倍之 Mouse anti-β tubulin（T4026, Sigma），作為細胞質蛋白標記；稀釋 1000 倍之 Rabbit anti-PARP（H-250）（sc-7150, Santa Cruz），作為核蛋白標記；
稀釋 500 倍之 Rabbit anti-GFP（FL）（sc-8334, Santa Cruz）與稀釋 3000 倍之 Mouse anti-1TBP18（Abcam）偵測 tNTBP-Q3/54-EGFP 融 合蛋白表現。使用的二級抗體為稀釋 10000 倍之 HRP conjugated
goat anti-mouse IgG （H&L）（Jackson）與 goat anti-rabbit IgG （H&L）
（Rockland）。
（八）細胞螢光觀察
培養 1.5 × 104 之 tNTBP-Q3-EGFP、tNTBP-Q54-EGFP 細胞於已 經過 poly-L-lysine（100 μg/ml, Sigma）處理 coverslips 的 12 孔盤 中，以 1 μg/ml doxycycline 誘導 2 天及 4 天後，進行固定染核，
其方法如下：細胞以 PBS 潤洗三次後，加入以 PBS 配製的 4%
paraformaldehyde 進行固定作用 10 分鐘，更換溶液為 PBS 配製的 0.1% Triton X-100 作用 10 分鐘。重複兩次後，以 PBS 潤洗兩次，
加入 0.05% DAPI （4’-6-diamidino-2-phenylindole，細胞核染劑），避 光作用 20-30 分鐘。之後以 PBS 清洗三次，進行封片。使用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現、聚集 情形與表現位置等。
（九）細胞存活率檢測