挑選經限制酵素圖譜分析與定序確認之重組載體菌落培養於含 篩選抗生素 1 ml 培養液中，於 37℃、200 rpm 培養 2-3 小時後倒 入 65 ml 含篩選抗生素培養液中，繼續培養隔夜。之後利用 Viogene
Ultrapure Plasmid Midiprep System（Midi-prep-V100）抽取質體 DNA 與純化。方法如下：先將菌液離心 8,000 rpm、5 分鐘，去除上清液，
加入 4 ml VP1 buffer，劇烈震盪使細菌懸浮，再加入 4 ml VP2 buffer，靜置 5 分鐘後，溫和反轉數次。然後加入 4 ml VP3 buffer，
反轉數次後，離心 12,000 rpm、4℃ 15 分鐘。此時準備 Midiprep - V100 管柱，加入 10 ml VP4 buffer，潤洗管柱內膜。接著將離心後 的上清液倒入管柱內，利用重力作用讓菌液通過管柱，並加入 15 ml VP5 buffer 清洗雜質。之後加入 5 ml VP6 buffer 沖洗出含有重組載 體 DNA 的溶液。接著加入 3.75 ml 異丙醇溫和反轉數次後，離心 14,000 rpm、10 分鐘，即可看到白色 DNA 沉澱物，再經溶解、二 次沉澱、70% 酒精清洗與風乾後，將 DNA 溶於 200 µl ddH2O，置 於 37℃ 水浴槽 10 分鐘，幫助 DNA 溶解。最後經限制酵素切割圖 譜分析確認與 OD260 測定 DNA 濃度，保存於 -20℃。
（四）誘導式 SCA17 細胞株建立
建 立 誘 導 式 SCA17 細 胞 模 式 的 流 程 如圖 一 所 示 。 Flp-InTM T-REXTM 293 細胞株基因上含有 FRT（Flp Recombinase Target）序列 與 TetR（Tet repressor）基因可調控下游基因表現，另有細胞抗生素 篩選基因（圖一 A ），藉由構築不完整 N 端 TBP 相連綠螢光蛋白
（tNTBP-Q3/54-EGFP ） 的 基 因 片 段 在 具 有 相 同 FRT 序 列 與
Hygromycin 篩選基因的 pcDNA5/FRT/TO 表現載體上，與表現重組 酵素（Flp Recombinase）的 pOG44 載體共轉移至 Flp-InTM T-REXTM 293 細胞株中（圖一 B ），可將不完整 N 端 TBP 相連綠螢光蛋白 的（tNTBP-Q3/54-EGFP）基因片段單一重組嵌入細胞基因中。而 pcDNA5/FRT/TO 載 體 上 能 驅 動 tNTBP-Q3/54-EGFP 表 現 的 CMV/TetO2 啟動子，被 TetR 蛋白結合時，會抑制基因的表現，因此 利用加入 tetracycline 或結構類似物 doxycycline 與 TetR 蛋白結 合，進而抑制 TetR 蛋白與啟動子結合，使 tNTBP-Q3/54-EGFP 表現
（ 圖 一 C ）。 本 實 驗 中 即 利 用 1 μg/ml doxycycline 誘 導 tNTBP-Q3/54-EGFP 表現，並觀察誘導 2 天及 4 天細胞表現情形。
先取 DNA 量為 1 比 9 的 pcDNA5-tNTBP-Q3/54-EGFP 重組 質載體與 pOG44 載體，總 DNA 量為 2.5 μg，以等體積混勻，加入 不含血清與抗生素之 OptiMEM 培養液（Gibco）至 100 μl 混勻作 用 5 分鐘。再配製 4 μl 脂質試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen）
混以 OptiMEM 培養液至 100 μl，作用 5 分鐘。接著於 12 孔細胞 培養盤中，每孔各加入 100 μl 的 DNA 混合液與 Lipofectamine 2000 混合液，充分混勻作用 20 分鐘後，加入 1 ml 含有 1 × 106 的 Flp-InTM T-REXTM 293 細胞液混合均勻。此時使用 DMEM 含 10%
FBS 但不加入篩選抗生素之培養液進行培養。待細胞貼附後，改以
DMEM 含 10% FBS 並加入 200 μg/ml Hygromycin B 及 15 μg/ml Blasticidin S 進行篩選基因轉移成功的細胞株。另外，共轉移空載體 pcDNA5/FRT/TO（簡稱 Vec）與 pOG44 載體至 Flp-InTM T-REXTM 293 細胞中，當作控制組。
（五）誘導式 SCA17 細胞株的 RNA 分析