MTT 細胞增生檢測（MTT cell proliferation assay）…

如上述，培養細胞於 96 孔盤中，24 小時後，進行 0 μM、20 μM、50 μM TBH 處理 24 小時後，加入 MTT 試劑（5 mg/ml, Sigma），作用 3 小時，測其 OD570，檢測細胞存活率（cell viability），實驗進行三重複，每次實驗亦進行三重複。

候選藥物 valproate（簡稱 VPA）為組蛋白去乙醯酶抑制劑

（histone deacetylases inhibitor），其檢測方法如下：先培養 0.5 × 10⁴ 誘導式細胞於 96 孔盤中，24 小時後，進行 0 μM、100 μM、200 μM、500 μM VPA 處理 48 小時，控制組加入 ddH₂O 不進行誘導，

實驗組加入 1 μg/ml doxycycline 進行誘導表現，經 48 小時，再加入 MTT 試劑（5 mg/ml, Sigma），作用 3 小時，測其 OD₅₇₀，檢

測細胞存活率（cell viability），實驗進行三重複，每次實驗亦進行三重複。

肆、結果

一、TBP 等位基因之族群遺傳分析

為瞭解臺灣人族群中 TBP 等位基因的 CAG/CAA 三核苷酸重複次數的情形與分布，以及與神經退化性疾病之間的相關性，我們藉由基因型分析技術，完成 69 位正常人的 138 條染色體，74 位帕金森氏症患者的 148 條染色體，55 位原發性顫抖患者的 110 條染色體與 86 位其它神經退化性疾病患者或家屬 172 條染色體的遺傳分析。由圖二分析結果，在正常人族群中 TBP 等位基因 CAG/CAA 三核苷酸重複次數的頻率分布在 32 到 43 個之間，以 36 個重複序列的等位基因最常見，佔 67.2%；帕金森氏症患者族群之頻率分布在 33 到 43 個之間，36 個重複序列的頻率最高，佔 60.8%；原發性顫抖患者族群其頻率分布在 29 到 40 個之間，以 36 個重複序列佔 55.7% 居多；其它神經退化性疾病患者或家屬的族群則分布在 27 到 45 個之間，也以 36 個重複序列佔 68.8% 最多。各族群間 TBP 等 位基因 CAG/CAA 重複次數的詳細情形與頻率列於表二。

圖三為各族群中每一樣本 TBP 等位基因 CAG/CAA 重複次數分布情形。在所分析的族群樣本中，發現在其它神經退化性疾病患者

或家屬的族群中有兩個具有不正常擴增的 CAG/CAA 重複序列：包括一位眼咽肌肉失調症（oculopharyngeal muscular dystrophy，簡稱 OPMD）病人含有 45 個重複序列，與一位妥瑞氏症、抽動症（tic syndrome，簡稱 TICS）病人具有 44 個重複序列，其 CAG/CAA 重複序列變異的情形均經定序分析後如表三所示。

二、淋巴細胞株對氧化壓力之耐受性

由於氧化壓力可能參與 polyQ 疾病的致病機轉，因此我們想測試帶有擴增 polyQ 蛋白的 SCA17 細胞株是否對氧化壓力耐受性較差，進而促使細胞死亡。所以，我們利用正常人與 SCA17 病患的淋巴細胞株經血清去除與氧化劑 TBH 處理後，以 Trypan blue 排除檢測法計算細胞死亡率，並將結果以各株 10% 血清與 0 μM TBH 處理為 100%

後，進行標準化，計算相對細胞死亡率。結果如圖四所示，淋巴細胞株於正常 10% 血清培養下，處理 10 μM TBH 24 小時後，三位正常人的相對細胞死亡率在 100.3% 到 110.4% 之間，SCA17 病患則在 103.4% 至 124.7% 之間，其中 CC3313（P1）與 CC4179（P2）兩 位病患的細胞死亡率顯著上升（P 值分別為 0.003；0.033）。進一步，

在同樣正常血清培養下，10 μM TBH 處理 48 小時後，三位正常人的相對細胞死亡率在 109.3% 到 115.6% 之間，SCA17 病患則在

117.6% 至 131.6% 之間，其各株淋巴細胞株相對細胞死亡率大多隨 TBH 處理時間增長而有所上升，並且與前述處理 24 小時 10 μM TBH 的兩株病患淋巴細胞株 CC3313（P1）與 CC4179（P2）在 10 μM TBH 處理 48 小時後，細胞死亡率也達顯著水準（P 值分別為 0.019；0.011），有明顯增加的情形。

此外，在血清去除處理下，各株淋巴細胞株其相對細胞死亡率在 111.1% 到 163.5% 之間，其中三位正常人與兩位 SCA17 病患的細胞死亡率都有顯著上升。接著，於無血清培養狀況，進行 10 μM TBH 處理 24 小時後，三位正常人的相對細胞死亡率在 123.3% 到 158.3% 之間，SCA17 病患則在 155.0% 到 207.5 % 之間，細胞死亡率均有顯著增加，顯示在血清去除與 TBH 雙重處理下，無論 SCA17 病患或正常人的淋巴細胞株其細胞均有嚴重死亡情形。另一方面，當以各株淋巴細胞株於相同血清去除條件下，統計分析 0 μM TBH 與 10 μM TBH 處理的細胞死亡率，則可發現三位 SCA17 病患 CC3313（P1）、CC4179（P2）與 CC4179（P3）在處理 10 μM TBH 後，細胞死亡率有明顯增加，均達顯著水準（P 值分別為 0.003；

0.002；0.008），而三位正常人淋巴細胞株無顯著差異，代表 SCA17 病患的淋巴細胞株在無血清狀況下面臨氧化壓力時，比起正常人更容易導致細胞死亡。

三、淋巴細胞株之熱休克蛋白表現

進一步我們想瞭解在處理血清去除、氧化劑 TBH 或兩種處理共同作用下，正常人與 SCA17 病患淋巴細胞株的熱休克蛋白表現情形是否有差異。由圖五利用西方轉漬法，以抗體 GRP78 偵測 HSPA5 的結果可看到不同處理情形下，三位 SCA17 病患與三位正常人的 HSPA5 蛋白表現並無明顯差別。接著將結果經 AlphaImager 軟體分析後，以正常人淋巴細胞株 95CT277（C1）之 HSPA5 對 β-actin 蛋白表現強度的相對比值當作 1.0 後，進行標準化，計算相對蛋白表現量，如圖六所示，於不同處理情形下，各株淋巴細胞株相對蛋白表現量在 0.89 至 1.21 之間。而經 ANOVA 單因子變異數分析後，

SCA17 病患與正常人兩群淋巴細胞株的 HSPA5 相對蛋白表現量並無顯著差異。

同時也利用抗體 HSC70 與 HSPB1 偵測淋巴細胞株 HSPA8 及 HSPB1 的表現。其結果在圖七可發現於正常血清培養及 TBH 處理兩種狀況下，HSPA8 蛋白表現情形在各淋巴細胞株間並未有明顯不同。但在血清去除處理以及給予血清去除與 TBH 共同處理的兩種情形下，則三位 SCA17 病患的 HSPA8 蛋白表現都比三位正常人較多。進而計算相對蛋白表現量與 ANOVA 單因子變異數分析後，在

正常血清培養及 TBH 處理兩種狀況下，各株淋巴細胞株 HSPA8 的相對蛋白表現量在 0.98 與 1.18 之間，兩群淋巴細胞株間無明顯差異。然而在血清去除處理以及給予血清去除與 TBH 共同處理情形下，SCA17 病患的 HSPA8 相對蛋白表現量在 1.15 到 1.29 間，正常人則在 0.90 與 1.14 之間，分析兩群淋巴細胞株間的 HSPA8 相對蛋白表現量確實達顯著差異，表示 SCA17 病患的 HSPA8 相對蛋白表現量比正常人高，如圖八所示。

由圖七結果亦可發現在不同處理狀況下，HSPB1 的蛋白表現在各淋巴細胞株間有不同的差異變化。其中 SCA17 病患淋巴細胞株 CC4524（P3）與正常人淋巴細胞株 95CT167（C3）的 HSPB1 的蛋白表現有較多的情形。另外兩位 SCA17 病患淋巴細胞株 CC3313

（P1）與 CC4179（P2），其 HSPB1 的蛋白表現似乎較少。正常人淋巴細胞株 95CT209（C2）的 HSPB1 的蛋白表現最低。圖八則由蛋白表現結果計算相對蛋白表現量，並進行 ANOVA 單因子變異數分析，顯示 SCA17 病患與正常人的 HSPB1 相對蛋白表現量在 0.71 到 1.22 間，兩群淋巴細胞株間並無明顯差異。

四、誘導式 SCA17 細胞模式之建立

為建立誘導式 SCA17 細胞模式，首先將不完整 N 端 TBP 相連綠螢光蛋白的（ tNTBP-Q3/54-EGFP ）基因片段構築於 pcDNA5/FRT/TO 表現載體上，再與pOG44 載體共轉移至 Flp-In^TM T-REX^TM293 細胞株，使 tNTBP-Q3/54-EGFP 基因片段單一重組嵌入細胞基因中。之後進行抗生素篩選二週，開始確認誘導式 SCA17 細胞模式 tNTBP-Q3/54-EGFP 基因表現情形。除 tNTBP-Q3/54-EGFP 細胞外，亦建立僅含 pcDNA5/FRT/TO 表現載體的細胞株（vector），

作為比較的控制組。

接著利用同步定量 PCR ，偵測內生性 TBP 及外源性 tNTBP-Q_3/54-EGFP 的 mRNA 表現，並將結果相對於 HuHPRT mRNA 表現量作圖。如圖九（A）所示，誘導表現 0、2、4 天後，

vector 細胞的TBP / HuHPRT 的相對表現量為 0.24、0.27、0.25，

tNTBP-Q₃-EGFP 細胞的 TBP / HuHPRT 的相對表現量為 0.81、

19.69、16.90，tNTBP-Q₅₄-EGFP 細胞的 TBP / HuHPRT 的相對表現 量為 0.84、17.29、18.84。扣除 Vec 所代表的內生性表現量後，以無誘導當作 1.0 倍，計算 tNTBP-Q_3/54-EGFP 基因的 mRNA 誘導表現倍數，從圖九（B）可知 tNTBP-Q₃-EGFP 基因在誘導表現 2 天後，

mRNA 增加約 34 倍；在誘導表現 4 天後，mRNA 增加約 29 倍；

tNTBP-Q₅₄-EGFP 基因則在誘導表現 2 天後，mRNA 增加約 28

倍，4 天後增加約 31 倍。由此可知，利用 Flp-In T-Rex 的誘導系統所建立的 SCA17 細胞模式，在誘導表現 2 – 4 天後，可誘導表現 tNTBP-Q3/54-EGFP 的 mRNA ，且倍數約達 30 倍。

進一步利用西方轉漬法，以抗體 GFP 辨識 tNTBP-Q_3/54-EGFP 的綠螢光融合蛋白，並使用 1C2 抗體辨識 polyQ 蛋白，其結果如圖十所示。首先 GFP 抗體辨識到蛋白分子量約在 35 kDa 的蛋白，

符合預期的 tNTBP-Q₃-EGFP 蛋白分子量大小，且可發現經誘導表現 2 天與 4 天的 tNTBP-Q₃-EGFP 蛋白，明顯比無誘導時增加許多。

同時，GFP 抗體也可辨識到蛋白分子量約在 45 kDa 的蛋白，接近預期 tNTBP-Q₅₄-EGFP 表現蛋白的分子量大小，進而比較無誘導與誘導 2 天、4 天後蛋白表現情形，可發現 tNTBP-Q₅₄-EGFP 蛋白表現均有明顯增加。並且值得注意的是，在無誘導狀況下，細胞即有低表現量的 tNTBP-Q_3/54-EGFP 蛋白產生。此外，Vec 為轉移入空載體的對照組，因此有無誘導表現，均未被 GFP 抗體所辨識。再者，1C2 抗體也約在 45 kDa 處辨識到帶有 polyQ 的 tNTBP-Q₅₄-EGFP 蛋白。因此，綜合以上結果，顯示所建立的誘導式 SCA17 細胞模式可穩定誘導表現 tNTBP-Q_3/54-EGFP 蛋白。

然後，藉由 tNTBP-Q3/54-EGFP 融合的綠螢光蛋白，將誘導式 SCA17 細胞株進行 DAPI 細胞核染色，以螢光顯微鏡觀察細胞內

tNTBP-Q3/54-EGFP 蛋白表現位置與情形。由圖十一可清楚看到在誘導 2 天或 4 天後，tNTBP-Q3-EGFP 蛋白於細胞內表現呈均勻分散，無蛋白聚集產生。而由圖十二，則明顯看到 tNTBP-Q54-EGFP 蛋白在誘導 2 天或 4 天後，於細胞內表現，並有少數細胞出現小量蛋白聚集的情形，且誘導 4 天後，產生蛋白聚集的細胞有增加的趨勢，

然而大部分細胞 tNTBP-Q54-EGFP 蛋白表現仍呈現均勻分散狀況。

再者，藉由次細胞蛋白質分群方法，分為細胞質蛋白與核蛋白萃取液，偵測 tNTBP-Q_3/54-EGFP 蛋白於不同次細胞蛋白質分群中的表現，以瞭解 tNTBP-Q_3/54-EGFP 蛋白於細胞內表現之區域。分析結果如圖十三所示，首先可發現細胞質蛋白標記 β-tubulin（55 kDa）於細胞質蛋白萃取液中表現量明顯較多；而核蛋白標記poly

（ADP-ribose）polymerase（簡稱 PARP，不活化態為 116 kDa；活化態為 85 kDa）於核蛋白萃取液中表現量較多，顯示次細胞蛋白質分群方法確實可初步分離細胞質蛋白與核蛋白。接著以 TBP 與 GFP 抗體皆可偵測到 tNTBP-Q₃-EGFP 與 tNTBP-Q₅₄-EGFP 蛋白於細胞質中表現量居多，而在核內也有低表現量。

五、誘導式 SCA17 細胞模式對藥物之敏感性

在確認建立的誘導式 SCA17 細胞模式可穩定誘導表現

在文檔中第十七型脊髓小腦運動失調症：遺傳檢測暨細胞模式之氧化壓力與細胞毒性研究 (頁 38-97)