DNA 片段純化 - 第十七型脊髓小腦運動失調症：遺傳檢測暨細胞模式之氧化壓力與細胞毒性研究

將限制酵素作用過之載體 DNA，進行洋菜膠電泳分離，切下所需的 DNA 片段，利用 Gel extraction kit（Viogene）進行膠體純化，

其方法如下：先加入 700 µl GEX buffer，置於 60℃ 乾浴器中 10 分鐘，使膠體溶解後，移至純化管柱中，離心 13,000 rpm、1 分鐘，去除廢液。加入 500 µl wash I buffer，離心 13,000 rpm、1 分鐘，去除廢液。接著加入 700 µl wash II buffer，離心 13,000 rpm、1 分鐘，去除廢液。再次離心 13,000 rpm、1 分鐘後，將管柱移至新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 20 µl ddH2O，靜置於室溫 5-10 分鐘，離心 13,000 rpm、1 分鐘，收集溶液，即完成 DNA 片段純化。最後取 2 µl 純化後的 DNA 進行洋菜膠電泳檢查。

2. 轉形勝任細胞（Competent cells）製備

接種大腸桿菌 TOP-10 F' （Invitrogen）單一菌落至 1 ml 含 tetracycline 的 LB 培養基中（10 g/l trypton - 5 g/l yeast extract - 10 g/l NaCl），於 37^oC、200 rpm 震盪培養。4-6 小時後倒入 100 ml LB 中，

以 37^oC、200 rpm 繼續震盪培養隔夜。然後平均倒入四個 500 ml 錐形瓶中，每瓶各含 250 ml LB，繼續培養約 4-6 小時，使 OD600 達到 0.6-0.7。接著將菌液置於冰上 10 分鐘，離心 4,000 rpm、4℃ 5 分鐘沉澱細菌細胞，並去除上清液。加入 250 ml 預冷之 ddH2O 懸浮細胞，再次離心 4,500 rpm、4℃ 5 分鐘，去除上清液，共重複四次

清洗細胞。最後加入 1 ml 20% glycerol 懸浮細胞，分裝成每管 40 µl，保存於 -80℃ 備用。

3. 接合反應

在總反應體積為 5 µl 的接合反應中，取適量純化的 DNA 片段、0.5 µl 的 10 × bufffer（300 mM Tris - HCl pH7.8 - 100 mM MgCl2

- 100 mM DTT - 10 mM ATP ）與 0.25 µl T4 DNA ligase（3U），混合均勻後，於 16℃ 作用隔夜。

4. 細菌轉形作用（Transformation）

將接合反應完成之溶液置於 70℃ 乾浴器中作用 10 分鐘，終止 T4 DNA ligase 的酵素反應，並迅速置於冰上。於冰上解凍轉形勝任細胞，取 20 µl 的勝任細胞加入 2 µl 完成接合反應的重組載體 DNA ，混合均勻後，以 1.25 kV 、 25 µF 、 200 Ω 進行電穿孔

（electroporation）（BIO-RAD, GENE PULSERII），完成轉形作用。然後加入預冷的 500 µl LB，於 37℃ 培養 30 分鐘，各取 150-200 µl 至每盤含 50 µg/ml 青黴素（ampicillin）的 LB 培養基中，最後以滅菌過玻棒將菌液均勻塗抹，將培養皿置於 37℃ 培養箱中繼續培養 16-18 小時。

5. 質體 DNA 小量製備

利用滅菌牙籤挑選轉形作用後生長出的單一菌落，劃在含篩選抗生素的培養基上保留菌種，同時置於含篩選抗生素的 1 ml 培養液中，於 37℃、200 rpm 培養隔夜。之後將菌液離心 13,000 rpm、1 分鐘，去除上清液。接著以鹼性溶菌法抽取質體 DNA，其方法如下：

加入 70 µl solution I（50 mM glucose - 25 mM Tris-HCl pH8.0 - 10 mM EDTA pH8.0）劇烈震盪使菌液懸浮。再加入 140 µl solution II（0.2 N NaOH - 1% SDS），溫和反轉數次後，加入 105 µl solution III（3M potassium acetate），溫和反轉數次。離心 14,000 rpm、10 分鐘以沉澱細胞碎片，取出含有核酸之上清液，加入 0.8 倍體積異丙醇，溫和混合均勻後，再次離心 14,000 rpm、1 分鐘，去除上清液，可見白色核酸沉澱物。以 70% 酒精清洗多餘鹽類後，倒扣風乾，再將沉澱物溶於 40 µl 含 10 µg/ml RNase 的 ddH2O 中，置於 37℃ 水浴槽 10 分鐘，幫助 DNA 溶解。最後取 2 µl 以 0.8% 洋菜膠電泳檢查重組載體 DNA 大小的正確性，並以限制酵素切割確認插入片段的正確性。

6. 質體 DNA 大量製備

挑選經限制酵素圖譜分析與定序確認之重組載體菌落培養於含篩選抗生素 1 ml 培養液中，於 37℃、200 rpm 培養 2-3 小時後倒入 65 ml 含篩選抗生素培養液中，繼續培養隔夜。之後利用 Viogene

Ultrapure Plasmid Midiprep System（Midi-prep-V100）抽取質體 DNA 與純化。方法如下：先將菌液離心 8,000 rpm、5 分鐘，去除上清液，

加入 4 ml VP1 buffer，劇烈震盪使細菌懸浮，再加入 4 ml VP2 buffer，靜置 5 分鐘後，溫和反轉數次。然後加入 4 ml VP3 buffer，

反轉數次後，離心 12,000 rpm、4℃ 15 分鐘。此時準備 Midiprep - V100 管柱，加入 10 ml VP4 buffer，潤洗管柱內膜。接著將離心後的上清液倒入管柱內，利用重力作用讓菌液通過管柱，並加入 15 ml VP5 buffer 清洗雜質。之後加入 5 ml VP6 buffer 沖洗出含有重組載體 DNA 的溶液。接著加入 3.75 ml 異丙醇溫和反轉數次後，離心 14,000 rpm、10 分鐘，即可看到白色 DNA 沉澱物，再經溶解、二次沉澱、70% 酒精清洗與風乾後，將 DNA 溶於 200 µl ddH2O，置於 37℃ 水浴槽 10 分鐘，幫助 DNA 溶解。最後經限制酵素切割圖譜分析確認與 OD260 測定 DNA 濃度，保存於 -20℃。

（四）誘導式 SCA17 細胞株建立

建立誘導式 SCA17 細胞模式的流程如圖一所示。 Flp-In^TM T-REX^TM293 細胞株基因上含有 FRT（Flp Recombinase Target）序列與 TetR（Tet repressor）基因可調控下游基因表現，另有細胞抗生素 篩選基因（圖一 A ），藉由構築不完整 N 端 TBP 相連綠螢光蛋白

（tNTBP-Q_3/54-EGFP ）的基因片段在具有相同 FRT 序列與

Hygromycin 篩選基因的 pcDNA5/FRT/TO 表現載體上，與表現重組酵素（Flp Recombinase）的 pOG44 載體共轉移至 Flp-In^TM T-REX^TM 293 細胞株中（圖一 B ），可將不完整 N 端 TBP 相連綠螢光蛋白 的（tNTBP-Q3/54-EGFP）基因片段單一重組嵌入細胞基因中。而 pcDNA5/FRT/TO 載體上能驅動 tNTBP-Q3/54-EGFP 表現的 CMV/TetO2 啟動子，被 TetR 蛋白結合時，會抑制基因的表現，因此利用加入 tetracycline 或結構類似物 doxycycline 與 TetR 蛋白結合，進而抑制 TetR 蛋白與啟動子結合，使 tNTBP-Q3/54-EGFP 表現

（圖一 C ）。本實驗中即利用 1 μg/ml doxycycline 誘導 tNTBP-Q3/54-EGFP 表現，並觀察誘導 2 天及 4 天細胞表現情形。

先取 DNA 量為 1 比 9 的 pcDNA5-tNTBP-Q_3/54-EGFP 重組質載體與 pOG44 載體，總 DNA 量為 2.5 μg，以等體積混勻，加入不含血清與抗生素之 OptiMEM 培養液（Gibco）至 100 μl 混勻作用 5 分鐘。再配製 4 μl 脂質試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen）

混以 OptiMEM 培養液至 100 μl，作用 5 分鐘。接著於 12 孔細胞培養盤中，每孔各加入 100 μl 的 DNA 混合液與 Lipofectamine 2000 混合液，充分混勻作用 20 分鐘後，加入 1 ml 含有 1 × 10⁶的 Flp-In^TM T-REX^TM 293 細胞液混合均勻。此時使用 DMEM 含 10%

FBS 但不加入篩選抗生素之培養液進行培養。待細胞貼附後，改以

DMEM 含 10% FBS 並加入 200 μg/ml Hygromycin B 及 15 μg/ml Blasticidin S 進行篩選基因轉移成功的細胞株。另外，共轉移空載體 pcDNA5/FRT/TO（簡稱 Vec）與 pOG44 載體至 Flp-In^TM T-REX^TM 293 細胞中，當作控制組。

（五）誘導式 SCA17 細胞株的 RNA 分析

1. RNA 萃取

利用 Trizol reagent （Invitrogen）進行 RNA 萃取，細胞以 PBS 清洗過後，加入 500 μl Trizol reagent 沖散在培養盤上的細胞並收集至微量離心管。冰上作用 5 分鐘後，加入 1/5 倍體積的 chloroform 並上下反轉，使之混合均勻，置於冰上作用 5 分鐘。離心 13,000 rpm、4℃ 15 分鐘，以分離 RNA、DNA 和蛋白質。小心吸取含有 RNA 的上清液至乾淨微量離心管中，並加入 0.8 倍體積的 isoprooanol 混合均勻，-20℃ 作用至少 1 小時。再次離心 13,000 rpm、4℃ 15 分鐘，以沉澱 RNA。去除上清液後，加入 1 ml 70%

EtOH（in DEPC- ddH₂O）潤洗。離心 13,000 rpm、4℃ 5 分鐘後，

去除上清液，留下 RNA pellet 風乾。最後加入適量 DEPC-ddH₂O 使 RNA 回溶。進一步，利用 0.8% 洋菜膠電泳確認 RNA 品質。並測定 OD₂₆₀得知 RNA 濃度，保存於 -80℃。

2. 反轉錄作用（Reverse transcription）

先取 6.25 μg RNA 加入 0.5 μl Rnase-free Dnase 進行總體積 25 μl 的酵素作用，接著利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Cat. No.4368814, Applied Biosystems）進行反轉錄作用，其方法如下：取 2 µg 的 RNA，反應總體積為 20 µl，溶液中包含 2 µl 10 × RT buffer、0.8 µl 25 × dNTP Mix（100 mM）、2 µl 10 × RT Random primer、1 µl MultiScribe^TM reverse transcriotase，反應條件為 25℃ 10 分鐘，再以溫度 37℃，作用 120 分鐘，最後 85℃ 5 秒終止反應。

完成反轉錄作用之 cDNA 產物保存於 -20℃。

3. 同步定量 PCR（Real-time PCR）

同步定量 PCR 使用的 TBP 螢光探針為 Hs 00920494_m1

（ TaqMan, Applied Biosystems ）， HSPB1 螢光探針為 Hs 00356629_g1（TaqMan, Applied Biosystems），且皆使用 HuHPRT 螢光探針（4326321E, Applied Biosystems）當內生性對照組。反應溶液總體積為 25 μl，包含 25 或 50 ng cDNA、1 × mix solution（2 × TaqMan Universal PCR Master mix - 20 × Primer/Probe mixture）。反應以 ABI PRISM 7000 Sequence Detectin System 儀器進行，條件設定為 50℃ 2 分鐘，再 95℃ 10 分鐘裂解雙股 cDNA，接著以循環式的裂

解溫度 95℃ 15 秒，60℃ 60 秒，進行 40 個循環作用後，以 ABI 前述 Goat anti-GRP-78、Goat anti-HSC70、Goat anti-HSPB1、Mouse anti-β actin 外，另使用 Rabbit anti-GFP （BD）稀釋 400 倍與 Mouse anti-1C2 （Chemicon）稀釋 10000 倍進行檢測 tNTBP-Q3/54-EGFP 的融合蛋白分子量的正確性與表現情形（1C2 為辨識擴增聚麩醯胺鏈的專一性抗體）。使用之二級抗體除上述之 HRP conjugated donkey anti-goat IgG （H&L）與 goat anti-mouse IgG （H&L）外，尚包含稀釋 2000 倍之 alkaline phosphatase （AP） conjugated goat anti-rabbit IgG （H&L）（Zymed）與 goat anti-mouse IgG （H&L）（Zymed）。

上述蛋白質萃取實驗重複進行兩次，每次萃取的蛋白液重複兩次西方轉漬分析。最後將四次呈色結果利用 AlphaImager 軟體進行定量分析。

（七）次細胞蛋白質分群（Subcellular protein fractionation）分析

利用 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Cat.

No. 78833, Pierce）進行次細胞蛋白質分離及製備，其方法如下：離心 500 g、4℃ 3 分鐘，收集誘導 2 天的誘導式 SCA17 細胞（20 µl 體積），加入 200 µl 含有蛋白酶抑制劑（protease inhibitors）之 CER I，震盪 15 秒，使細胞完全懸浮，置於冰上作用 10 分鐘。再加入 11 µl CER II，震盪 5 秒，冰上作用 1 分鐘後，再次震盪 5 秒，取 30 µl 溶液當總蛋白質萃取液（total protein extract）。離心 16,000 g、4

℃ 5 分鐘，取出上清液即細胞質蛋白萃取液（cytoplasmic extract）。

底層不溶解物質，加入 100 µl NER，進行震盪 15 秒，冰上作用 10 分鐘，重複四次共 40 分鐘，使其完全溶解。離心 16,000 g、4℃ 10 分鐘，取出上清液即核蛋白萃取液（nuclear extract）。總蛋白質經定量後，取相同體積之總蛋白質、細胞質蛋白與核蛋白萃取液，進行西方轉漬蛋白質分析。使用一級抗體包含：稀釋 2000 倍之 Mouse anti-β tubulin（T4026, Sigma），作為細胞質蛋白標記；稀釋 1000 倍之 Rabbit anti-PARP（H-250）（sc-7150, Santa Cruz），作為核蛋白標記；

稀釋 500 倍之 Rabbit anti-GFP（FL）（sc-8334, Santa Cruz）與稀釋 3000 倍之 Mouse anti-1TBP18（Abcam）偵測 tNTBP-Q_3/54-EGFP 融合蛋白表現。使用的二級抗體為稀釋 10000 倍之 HRP conjugated

goat anti-mouse IgG （H&L）（Jackson）與 goat anti-rabbit IgG （H&L）

（Rockland）。

（八）細胞螢光觀察

培養 1.5 × 10⁴之 tNTBP-Q3-EGFP、tNTBP-Q54-EGFP 細胞於已經過 poly-L-lysine（100 μg/ml, Sigma）處理 coverslips 的 12 孔盤中，以 1 μg/ml doxycycline 誘導 2 天及 4 天後，進行固定染核，

其方法如下：細胞以 PBS 潤洗三次後，加入以 PBS 配製的 4%

paraformaldehyde 進行固定作用 10 分鐘，更換溶液為 PBS 配製的 0.1% Triton X-100 作用 10 分鐘。重複兩次後，以 PBS 潤洗兩次，

加入 0.05% DAPI （4’-6-diamidino-2-phenylindole，細胞核染劑），避光作用 20-30 分鐘。之後以 PBS 清洗三次，進行封片。使用 Leica TCS SP2 螢光顯微鏡觀察細胞形態、綠螢光融合蛋白的表現、聚集情形與表現位置等。

（九）細胞存活率檢測

1. WST-1 細胞增生檢測（WST-1 cell proliferation assay）

培養 1.5 × 10⁴ Vec、tNTBP-Q₃-EGFP、tNTBP-Q₅₄-EGFP 之誘導式細胞株於 96 孔盤中，每孔中含有 100 μl 之 DMEM 完全培養液（含 200 μg/ml Hygromycin B 及 15 μg/ml Blasticidin S），培養

24 小時後，實驗組加入 1 μg/ml doxycycline 進行誘導表現，控制組加入 ddH2O，經 24 小時後，進行 0 nM、20 nM、50 nM、100 nM Staurosporine（簡稱 STS）細胞凋亡誘導劑與 0 nM、20 nM、50 nM、

100 nM MG132 蛋白酶體抑制劑的處理 24 小時後，再加入 PreMix WST-1 細胞增生檢測試劑（Takara），作用 3 小時，測其 OD450，檢測細胞存活率（cell viability），每種藥物處理實驗進行三重複，每次實驗亦進行三重複。

2. MTT 細胞增生檢測（MTT cell proliferation assay）

如上述，培養細胞於 96 孔盤中，24 小時後，進行 0 μM、20 μM、50 μM TBH 處理 24 小時後，加入 MTT 試劑（5 mg/ml,

在文檔中第十七型脊髓小腦運動失調症：遺傳檢測暨細胞模式之氧化壓力與細胞毒性研究 (頁 27-0)