氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 OSC 各反應步驟探討 30

（一）開環起始反應

在人類OSC的結晶結構尚未被解析出來之前，科學家多藉由透過受 質類似物與OSC做親和性標定（Affinity labeling），或以定點突變的方

式來推測反應機制⁴²。1997年，Corey等人利用一系列的丙胺酸定點突變 式掃瞄法（alanine scanning site-directed mutagenesis）針對酵母菌ERG7

的活性區域內高度保留性的胺基酸進行實驗，實驗結果顯示酵母菌 ERG7中His146、His234、Asp456位置在催化機制上扮演十分重要的角

色^25,43。這些研究認為ERG7在催化環氧基開環反應時，His146會藉由氫

鍵拉扯效應來增強Asp456的酸性，進而提供質子促使環氧基質子化而開 環《圖1-17a》⁴⁴。同樣地，由人類OSC的X-ray結晶結構可以發現，Cys456 和Cys533兩者皆與Asp455間有氫鍵連結，可藉此增強Asp455的酸性以誘 導環氧基的質子化開環，同時Asp455還可透過與水分子及Glu459的羧酸 基團作用，或是藉由最後脫氫步驟的質子轉移而再質子化《圖1-17b》^45,46。 另外有許多研究也相信，在經由質子化開環反應後，會同步引起A環的 環化形成，這兩個步驟目前為止被認為是同步發生的^47-51。

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《圖1-17》a. 酵母菌OSC假設開環環化機制⁴³

b. 人類OSC開環環化機制

（二）環化的過程

早期在環化機制尚不清楚的時候，Matsuda等人在研究B環形成時發 現在酵母菌ERG7內的胺基酸Val454位置具有高度的保留性。同樣的，

對應到植物CAS的Ile481位置亦然。所以他們利用分子生物學的方法將 Val454突變成同為疏水性胺基酸的Phe、Leu與Ile，還有立體空間較為簡 單的Ala與Gly。實驗的結果顯示在Ala與Gly的突變中，會得到單環的產 物，所以他們認為Val454會藉由其立體空間較大的側鏈來幫助B環的形

成⁵²。

在2004年Nature所發表的人類OSC結晶結構中，Thoma等人指出幾個 具有高度保留性的胺基酸位置，其中Trp387、Phe444與Trp581（對應到 酵母菌ERG7分別為Trp390、Phe445與Trp587）會利用其含有苯環的側

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鏈，並透過碳陽離子-π共振交互作用來，穩定形成A環與B環時產生的 C-6和C-10的碳陽離子中間產物。然而，在酵母菌ERG7 Phe445的定點突

變實驗裡，卻得到了三環與在不同地方去質子化的四環產物。這也證明 了在酵母菌ERG7中，Phe445會影響在C環形成時的C-14碳陽離子中間物 與最後在C-8/C-9的去質子化步驟⁵³。另外，在B環形成時，能量較不傾

向的船形結構方面，Thoma認為Tyr98位置其立體空間較大的側鏈推動氧 化鯊烯C-10上的甲基至到分子平面之下，而進一步地阻礙B環形成能量 較傾向的椅形構形《圖1-18》⁴¹。

《圖1-18》Trp387、Phe444、Trp581穩定A環與B環形成時的C6、C10-碳陽離子中間物；Tyr98的側鏈藉由立體空間障礙促使B環形成能量較不

傾向的船形結構⁴¹

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在酵母菌ERG7胺基酸Trp390位置的飽和定點突變實驗結果中，果真

發現了單環的Achilleol A以及Camelliol C，這也證實了人類OSC中 Trp387是來穩定A環形成時的C6碳陽離子中間物；而在酵母菌ERG7胺基

得 到 665 三 環 的 產 物 (13αH)-isomalabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol 、 (13αH)-isomalabarica-14Z,17E,21–trien-3β-ol與羊毛硬脂醇等產物⁵⁵。

1995年，Corey等人在以20-oxaoxidosqualene取代氧化鯊烯作為受質 的實驗中，發現除了6-6-6-5的四環產物以外還有6-6-5的三環系統產物。

所以他們藉此結果推測，在C環形成的過程中會先形成五圓環，再經由 擴環反應而成為六圓環《圖1-19》^56,57。另一方面，利用電腦模擬所作的 理論能量計算方面，也認為C環的環化過程會先形成五圓環再行擴環作

用成為六圓環⁴⁸；Hess則從他的計算結果認為6-6-5的三環碳陽離子中間 物為環化過程中的第一個中間物，而之後C環與D環的形成會經由過渡 態之後同時發生，並非為先前所認為的會先形成六圓環的C環再行擴環

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作用而產生《圖1-20》^58,59。另外Gao在其以SHC為受質的理論計算的研

究中，則是認為在整個環化過程中只會生成單環與雙環的碳陽離子中間 物，其C、D與E環都是同時形成的⁶⁰。

《圖1-19》利用類似物作為受質結果顯示C環會先形成五圓環

《圖1-20》Hess認為C環與D環會經由過渡態之後同時形成⁶¹

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在人類OSC的結晶結構中，His232與Phe696被認為它們可以藉由其 胺基酸側鏈上所富含π電子的特性，來穩定形成C環時依反-馬可尼可夫

（anti-Markovnikov）法則產生二級碳陽離子，並且可以利用碳陽離子-π 共振作用來穩定帶有正電荷的高能C-20碳陽離子中間物。然而在酵母菌 ERG7 胺 基 酸 His234 位 置 的 定 點 突 變 實 驗 中 ， 也 發 現 了 (13RH)-isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol的三環產物⁶²；在酵母菌 ERG7胺基酸Phe699位置的定點突變實驗中，除了發現三環的相關產物 以外，還發現了在不同位置脫氫的產物，這結果顯示Phe699也會對C-17 碳陽離子有所影響⁶³。最後氧化鯊烯一連串的環化步驟會終止在五圓環 的D環所形成的C-20原脂醇碳陽離子，這是因為OSC缺少像SHC中 Trp169與Phe605的芳香族性官能基，因此無法藉由其π電子來穩定C-17 二級碳陽離子中間物使其有較長的生命期，而能更進一步的環化形成E 環。

（三）骨架重排與脫氫反應

在環化反應結束之後，酵素會藉由其活性內許多具有高度π電子性質 的芳香族基團之胺基酸（如Trp192、Trp230、His232、Tyr237、Tyr503、

Phe521與Phe696等），透過碳陽離子-π電子的共振作用來穩定甲基與氫

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化基的轉移重排，使得C-20四級原脂醇碳陽離子順利轉變成為C-8/C-9 碳陽離子中間物《圖1-21》^3,41。在整個骨架重排過程結束之後，於人類 OSC中，具有高度保留性的胺基酸His232（對應到酵母菌ERG7為His234），

由於其鹼性殘基十分靠近C-8/C-9碳陽離子，所以被認為是能夠接受質子，

並進而進行整個環化機制的最後步驟－脫氫反應的關鍵胺基酸位置。另 外，His232除了會透過鄰近的水分子的交互作用去影響催化反應的進行 外，還會與其附近的Tyr503之側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯作用，

使得His232得以位於脫氫反應的最佳位置《圖1-22》⁴¹。

《圖1-21》具有高度保留性的芳香族性胺基酸Trp192、Trp230、His232、

Tyr237、Tyr503、Phe521與Phe696可以利用碳陽離子與π電子共振交互 作用去穩定甲基與氫化基的骨架重排⁴¹。

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《圖1-22》氧化鯊烯環化酵素與其產物-羊毛硬脂醇形成複合物的結構圖。

圖中所顯示的胺基酸基團為距離產物在5Å內的位置，水分子只有在 Asp456及His232附近被觀察到⁴¹。

除了人類 OSC 的結晶結構外，His234、Trp232 與 Tyr510 的飽和定 點突變的實驗結果也更進一步的證明了這兩個胺基酸在活性區域內所 具有的功能。在酵母菌 ERG7 中 His234 的定點突變產生了許多在不同 地 方 進 行 脫 氫 反 應 的 四 環 產 物 如 protosta-20,24-dien-3β-ol 、 protosta-12,24-diene-3β-ol 還有 parkeol^62,64《圖 1-23》，而 Trp232 也在在 不同地方進行脫氫反應的四環產物產生 protosta-12,24-diene-3β-ol 還有

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parkeol，這證明這兩個胺基酸在重排以及脫氫反應上佔有重要的一席之 地，不同的是 Trp232 並未涉及影響環化的反應的進行。另外，在 Tyr510 突變成 Ala 的突變點中也發現了 parkeol^65,66。綜合以上結果，更加證明 了 His234 在酵母菌 ERG7 活性區域中的功能，除了利用碳陽離子-π 電 子的共振作用穩定甲基與氫化基的骨架重排以外，也會幫助酵素在正確 的位置上進行脫氫反應⁶⁷。

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《圖1-23》H234定點飽和突變的產物⁶²

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1.4.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）

在高等植物的脂醇生合成途徑中，受質氧化鯊烯會由氧化鯊烯-環阿

屯醇環化酵素催化其環化反應物，生成植物固醇的前驅物－環阿屯醇

（Cycloartenol），進一步的代謝形成最終產物植物固醇（Phytosterol）。

在阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環化酵素（CAS, EC 5.4.99.8）是由759個胺基酸所組成，分子量為86kDa。

機制上的相關性^34,68。

從熱力學的觀點來看，環阿屯醇比羊毛硬脂醇較為不穩定，所以學 者認為環阿屯醇環化酵素之所以可以將產物環化成為能量較不趨向的 環阿屯醇，可能是因為酵素CAS裡的某些特定胺基酸的作用。而在先前 對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素（AthCAS1）的突變實驗中也發現，Tyr410、

His477與Ile481在CAS環化機制中扮演著十分重要的角色^65-68。

這些胺基酸在各物種的CAS中皆具有高度保留的特性，但是在ERG7 中則分別以Thr、Cys、Gln及Val的形式存在《圖1-24》。所以這些胺基 酸被認為會促進環阿屯醇的形成，因此若將這些胺基酸進行突變也可以 得到羊毛硬脂醇⁶⁹。

《圖1-24》Tyr410 (◆), His477 (＊) and Ile481 (▼)在CAS1具有高度保留 性而在ERG7中則被Thr、Cys、Gln或是Val所取代⁷⁰

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舉例來說，Ile481在所有物種中的CAS皆具有高度保留性，而在ERG7 酸（如Ala與Gly）則會得到achilleol A與camelliol C《圖1-25、表1-1》。

在酵素CAS中，Tyr410與His257被認為在靠近C-19的位置會有氫鍵

配對的交互作用，因此可以藉此幫助最後的去質子化作用⁶⁹。而在 AthCAS1^Tyr410Thr的突變株中，產物會由原本的環阿屯醇變成75%羊毛硬

脂醇、24% 9β-lanosta-7, 24-dien-3β-ol以及1% achilleol A《圖1-25、表1-1》。 另外，若將Tyr410突變成為Thr時，則會減低碳陽離子中間物上方的立 體空間障礙，而且由於Thr上的氫氧基團較Tyr更接近α-碳，因此在 AthCAS1^Tyr410Thr突變株中，Tyr532與His257的極性基團將會被重新排列，

因而造成酵素CAS不會產生環阿屯醇，反而會在C-8/C-9部位上進行脫氫 反應而形成羊毛硬脂醇、parkeol 與9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol⁷¹。

CAS ^His477雖不位於受質鍵結的活性區域，但是曾有報導指出，位於

活化區外圍（second-sphere）的His477會與Tyr410產生氫鍵的交互作用

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而互相拉扯，進而影響環化機制的最終脫氫反應⁶⁹。His477在所有物種 的CAS中皆具有高度保留性，而在ERG7中則會以Gln或Cys取而代之。

在AthCAS1^His477Gln的突變株中，帶有極性的官能基會向C-11移動靠近，

造成在C-11位置行脫氫反應而產生parkeol多於羊毛硬脂醇的結果；而在 AthCAS1^His477Asn的突變株中，則會產生大量的羊毛硬脂醇，但由於其胺 基酸基團也夠靠近C-11的位置，所以也會產生Parkeol⁷²。

在整個CAS環化過程中，His257與Asp483被認為是CAS催化活性上

所必需。Asp483被認為會作為一個路易士酸來幫助環氧基的開環，以協

所必需。Asp483被認為會作為一個路易士酸來幫助環氧基的開環，以協