重組質體的建構

利用Stratagen公司所出品的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit建構質體。先設計含有飽和定點突變與靜默突變之互補引子。再以含

有正常功能的ERG7序列之載體RS314WT作為模板，利用QuikChange PCR的方法（圖2-1），建構飽和定點突變之質體。

《圖2-1》QuikChange Site-Directed Mutagenesis示意圖。

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（1） 設計引子

在下表中，將所要突變之胺基酸以灰色網底表示，其中N 代表A、T、

C 與G。另外，我們會在突變點之前建構一個靜默突變（Silent mutation），

藉此設計一個切位（以下標線表示之）作為酵素鑑定之用。

（2） QuikChange Site-Directed Mutagenesis

利用Stratagene公司（Merck代理）所出品的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，按照下表所列之溫度條件進行聚合酶連鎖反應來建構 飽和定點突變之質體DNA。

reagent Volume(μl)

Template 0.5 Primer1 (1000ng/μl) 0.5 Primer2 (1000ng/μl) 0.5

10X pfu Buffer 2

dNTP (2.5mM) 1.6

DDW 14.5

Pfu polymerase 0.4

《表2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所用材料條件

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segment cycles temperature time

《表 2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所使用之聚合酵素 放大步驟

（3） Dpn I 酵素切除母股DNA

將PCR 產物以下表之條件放置在水浴槽中於37℃下反應四個小時，

因DpnI 限制酶具有截切甲基化DNA 之特性，因此我們可以用其去除不 含有突變之母股DNA。

reagents Volume (μl)

PCR products 12

取少許XL1-Blue在含有Tetracycline（100 mg/L）的LB Agar培養皿上 劃四區，於37℃培養箱一天後。由Tetracycline/ LB Plate上挑取單一菌落

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培養於含有Tetracycline（100 mg/L）的3ml LB試管，同樣在37℃下於培 養箱隔夜培養。接著將菌液接種於1,000ml的SOB培養液（含有0.02 M的 MgCl²），於震盪培養箱中以37℃、250 rpm震盪條件培養4至5小時使其 OD⁶⁰⁰介於0.5至0.6之間。將菌液置於經高壓滅菌過之離心瓶中，並冰浴 十分鐘，接著在4℃下以4,100 rpm的條件離心十分鐘，待去除上清液之 後以經高壓滅菌過之二次水清洗pellet，冰浴十分鐘後，再以4,100 rpm、

4℃條件離心十分鐘。去除上清液後，以320ml TB buffer清洗pellet，並 重複上述條件離心之。倒除上清液後，以80ml TB buffer重新懸浮菌體，

繼而加入5.6 ml的DMSO冰浴十分鐘。取350μl菌液於經高壓滅菌後的微 量小管中，丟入液態氮急速冷凍，最後保存於-80℃冰箱即可。

（B）質體DNA 的轉殖與放大

從-80℃冰箱中取出勝任細胞於冰上緩慢解凍，取10 μl含有突變點之 質體DNA，並加入100μl的勝任細胞，冰浴20分鐘使質體DNA附著於細 胞的表面。置於42℃的水浴一分鐘，使細胞表面因熱產生小孔洞而促使 質體DNA進入細胞內。冰浴一分鐘後將菌液加入於1ml的LB試管中，以 37℃、200 rpm震盪條件培養一小時後，將菌液以6,000rpm的條件離心一 分鐘並去除上清液，接著在無菌環境下將菌液塗在LB plate（with

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Ampicillin 100mg/l），在37℃下培養約18小時後，挑取單一菌落培養於 3 ml的LB tube（with Ampicillin 100mg/l），於37℃、200 rpm震盪條件 下培養12小時即可抽取放大之質體DNA。

（C）限制酶鑑定

將放大抽取所得之含有突變的質體DNA，依下表所示之條件以所設 計之限制酶與特定緩衝液混和，並置於37℃水域槽中反應三小時，再以 DNA 電泳來確定質體是否含有所設計之突變點。

reagents Volume (μl)

Plasmid 0.5～3(視切後片段大小而定)

將上述經由限制酶鑑定過之含有突變的質體DNA 以SangerMethod

（dideoxynucleotide chain termination）進行定序。首先利用BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit以下表所示之材料條件下進行聚合酶連鎖反應，

其引子列於附錄一。在反應過後以酒精沈澱法取得DNA，再以ABI PRISM 3100 auto-sequencer進行定序反應。

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reagents Volume (μl)

Template 2

5X Sequencing Buffer 3

Primer 1 DDW 13.2

BigDye 3.1 0.8

《表2-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 之材料

segment cycles temperature time

1 1 95℃ 2 min

2 25

96℃ 10 sec

50℃ 5 sec

60℃ 4 min

3 1 4℃ 10min

《表2-7》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用溫度

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