第一章 序論
1.6 研究目的
氧化鯊烯環化酵素在三萜類生合成途徑中扮演著十分重要的角色，
由於其在生理及演化上的重要性，因此酵素的環化機制與其胺基酸基團 所具有的功能，一直是近年來科學家十分感興趣的研究課題。研究蛋白 質結構與功能的方法主要有下列兩種：核磁共振光譜及蛋白質X-ray 單 晶繞射（Protein X-ray Crystallography，X-ray diffraction）。但上述兩種
方法皆有所限制，核磁共振光譜只能夠解出分子量較小的蛋白質（小於 30kDa）；而在進行X-ray 單晶繞射之前則必須先純化出一定數量的蛋 白質，但是在利用蛋白質進行結晶試驗時，養晶的條件往往複雜不易拿 捏。而且，我們所研究的氧化鯊烯環化酵素是一種膜蛋白，分子量大而 且十分不穩定且不容易被純化，所以我們無法利用上述兩種方法來得到 氧化鯊烯環化酵素的結構與催化機制間的關係。目前在研究酵母菌 ERG7 最常見的方式包括利用生物資訊學的方式加以研究其催化機制 與抑制劑間的探討，另外也會利用序列比對，透過同源物種的結晶結構 來模擬探討其催化機制64，以及進行定點突變的實驗，藉由觀察產物來探 討反應機制。
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此研究題目主要是想要利用定點突變的方式研究氧化鯊烯環化酵素 家族之間彼此的關係《圖1-29》，在先前的研究之中有研究了突變SHC 上面三個胺基酸到OSC相對應的胺基酸，嘗試使得原本將鯊烯當作是受 質的SHC也能將氧化鯊烯當作是酵素的受質，而這個胺基酸的三點突變 是D377C/V380E/V381A，這個定點飽和實驗成功的使得SHC將氧化鯊烯 當作是受質，而且產生了產物3-hydroxyhopene74。而在CAS和OSC之間 的關係中，研究人員利用定點飽和突變將CAS上面的胺基酸突變成OSC 中相對應的胺基酸，分別是Y410T、H477N、I481V，成功的使得CAS 產生了OSC的產物羊毛硬脂醇，並在雙突變H477N/I481V中，更得到高 達99%的羊毛硬脂醇，這在先前的緒論也有詳細的說明。此外，在LUP 和BAS兩者之間也可經由突變成彼此相對應的胺基酸Leu256W(OEW) 和Trp259L(PNY)而產生對方的產物。
註：PNY的Trp259對應於PSY為Trp257
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《圖1-29》各物種間氧化鯊烯環化酵素相關性研究圖
在這些彼此的關係研究中，OSC和BAS之間的差異為何，這點在先 前的研究以及文獻鮮少提及，這兩者之間除了OSC為椅形-船形-椅形的
原脂醇碳陽離子，BAS為椅形-椅形-椅形的達瑪烯碳陽離子中間物之外，
最大的不同點在於形成這兩個在C20陽離子中間產物它們之後的步驟，
原脂醇碳陽離子會進行數個重排的步驟最後在C9的位置脫氫產生羊毛
硬 脂 醇 ， 而 達 瑪 烯 碳 陽 離 子 中 間 物 則 會 繼 續 進 行 環 化 反 應 形 成 Baccharenyl Cation intermediates，之後經過擴環、環化、重排的步驟形 成ß-香桂素《圖1-30》《圖1-31》。
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《圖1-30》BAS反應機制表示圖
《圖1-31》OSC和BAS之間反應機制的差異
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在這C20陽離子的環化與否引導出研究的方向，由於在先前的研究 上面從未嘗試過把原脂醇碳陽離子朝向著環化的步驟進行，因此在此研 究目的希望能使得原本進行重排的原脂醇碳陽離子繼續進行擴環、環化 而有不同立體構形的6-6-6-6四環產物或是五環的產物產生。
藉由生物資訊模擬的方式以人類OSC的結晶結構當作試模板找出 BAS C20周圍的胺基酸，發現這些胺基酸為《圖1-32》所示，其中和OSC 中不同的胺基酸為Tyr259和Phe125；根據芳香族胺基酸穩定碳陽離子的 假說，這兩個胺基酸可能就是影響是否繼續進行環化的重要胺基酸。
《圖1-32》BAS結構模擬圖中C20周圍之胺基酸
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但是在先前的研究已經完成了H234的定點飽和突變產物分析，只有
發現單還、三環以及四環的產物，並未發現有擴環或是繼續環化的產物，
根據這點，希望能從OSC的結構模擬中找出答案《圖1-33》，發現H234
的功能除了使得重排的位置正確之外，可能也是使原脂醇碳陽離子的長 碳鏈有180度旋轉的ㄧ個重要因素，因為它和受質的距離只有3.96埃，由 於空間的因素導致長碳鏈有外翻的動作，根據反應機制來說，尾部的長 碳鏈要維持在特定的角度之上才可以繼續進行擴環和環化的反應，
Tyr259也就扮演了這個角色，而H234產生的立體障礙使得長碳鏈進行旋 轉而生了重排反應，也就是阻斷了擴環以及環化的進行。
《圖1-33》OSC的結構模擬圖中C20周圍之胺基酸
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關於上面這一點的假設也可以在先前對於BAS的研究上面得到證實：
利用序列比對可得知BAS中的Tyr261(PNY)對應於OSC的H234，之後進 行Tyr261H的定點突變之後，發現其產物為《圖1-34》。
《圖1-34》飽合定點突變實驗中PNY的Tyr261H所產生的三種產物左邊
兩種異構產物即可發現尾端長碳鏈的角度是完全不同的，因此可推論 H234過近的距離所造成的立體障礙會使得在C20碳陽離子形成之後有
著＂甩尾＂的動作產生，也關係著下一個步驟為擴環亦或是重排反應。
既然H234被推論是重排以及側鏈旋轉的重要胺基酸，那麼，BAS上 的Phe125對應於OSC為M105是否就是擴環與否的重要胺基酸呢？
對於這個疑問，進行了序列比對的動作《圖1-35》，找尋在不同物
種間相同位置是否有高度保留或是有著相異的胺基酸，在比對後發現會 進行擴環反應的LUP和BAS皆為Phe這個芳香族的胺基酸，而進行重排卻 沒有進行擴環反應的OSC和CAS則為輸水性的長碳鏈胺基酸。
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P s _ B A S 1 1 7 A E N A G P L FFL P P L V M C L Y 1 3 3 O e _ L U P 1 1 6 A E S A G P L FFL P P L V L A L Y 1 3 2 A t _ C A S 1 1 6 G D Y G G P L FLL P A L V I G L Y 1 3 2 A t _ L A S 1 1 6 G D Y G G P M FLL P G L I I T L S 1 3 2 H s _ O S C 9 6 G D Y G G P L FLL P G L L I T C H 1 1 2 S c _ O S C 9 5 C Q Y K G P M FMT I G Y V A V N Y 1 1 1
《圖1-35》不同物種間的序列比對
結合上面論述，必須先將H234這個立體障礙除去之後穩定C20碳陽 離子，才可能有擴環的可能性。因此就直接進行雙點突變，將M105突 變成Phe。而H234突變成BAS相對應的Tyr以及兩種較小的胺基酸Gly和 Ala；也就是對於OSC的M105F+H234G/A/Y進行產物的分析。
在雙突變 M105F+H234G/A/Y 結果出來之後，更使得我們好奇 OSC 中 Met105 以及 BSA 中 Phe125 的功能性為何？因此接下來進行了這兩個點
的定點飽和突變。當然，首先做的也就是 OSC 的 M105F 以及 BAS 的 Phe125M，希望能藉此找出雙突變點所產生結果的原因。為了找出更加 清楚明白的原因，也進行了定點飽和突變的實驗。
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