國
立 交 通 大 學
生物科技研究所
碩士論文
利用定點飽和突變的方式對於氧化鯊烯環化酵素內
假設活性區域殘基進行結構與反應關係之研究
Studies of Structure-Reactivity Relationships on
Putative Active Site Cavity Residues of
Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase by
Site-Saturated Mutagenesis
研
究 生 : 胡天昶
指導教授
: 吳東昆 博士
利用定點飽和突變的方式對於氧化鯊烯環化酵素內
假設活性區域殘基進行結構與反應關係之研究
Studies of Structure-Reactivity Relationships on
Putative Active Site Cavity Residues of
Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase by
Site-Saturated Mutagenesis
研究生：胡天昶 Student: Tain-Chang Hu
指導教授：吳東昆 博士 Advisor: Prof. Tung-Kung Wu Ph.D
國
立 交 通 大 學
生物科技研究所
碩士論文
A Manuscript of Dissertation
Submitted to Department of Biological Science and Technology college of Biological Science and Technology
National Chiao Tung University
in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Philosophy
in
Biological Science and Technology Hsinchu, Taiwan, Republic of China
July, 2009
利用定點飽和突變的方式對於氧化鯊烯環化酵素內
假設活性區域殘基進行結構與反應關係之研究
學生: 胡天昶 指導教授: 吳東昆 博士摘要
在動物、真菌以及高等植物中的氧化鲨烯環化酵素會催化氧化鲨烯 形成四環或是五環的三萜類化合物。由於這種酵素只需要一個步驟就可 以完成複雜的環化以及重排反應，近半世紀以來引起科學家極大的興 趣。 在1992年，Griffin提出芳香族的胺基酸可以利用其π電子來穩定中間 產物所產生的碳陽離子，故芳香族胺基酸為重要殘基的可能扮演著十分 重要的角色。 為了釐清D環上的擴環反應是由哪些高度保留性的胺基酸所影響， 我們進行了定點飽和突變，特別是針對Pisum sativum鲨烯環化酵素中的 Phe125以及Saccharomyces cerevisiae鲨烯環化酵素中的Met105進行實 驗。 在Saccharomyces cerevisiae M105 定 點 突 變 實 驗 中 ， 在 突 變 成 G/A/S/N/Q/K會產生protosta-20,24-dien-3β-ol，藉由這結果的產生，推測 M105所扮演的角色是影響重排反應以及脫氫反應的位置，但是並未影 響環化反應。而Pisum sativum F125定點突變實驗中發現此點是影響酵 素的結構以及受質的進出。 IStudies of Structure-Reactivity Relationships on Putative
Active Site Cavity Residues of Oxidosqualene-Lanosterol
Cyclase By Site-Saturated Mutagenesis
Student: Tain-Chang Hu Advisor: Dr. Tung-Kung Wu
Abstract
Oxidosqualene cyclases catalyze the oxidosqualene into tetracyclic or pentacyclic triterpeniods in the animal, fungi and high plants. A serial cyclization / rearrangement cascades catalyzed in one-step reaction by oxidosqualene cyclases have fascinated the bioorganic researcher over a half century.
In 1992, Griffin proposed an aromatic hypothesis for stabilizing the respective carbocationic intermediates via “cation-π interaction” from the electron-rich indole ring of tryptophans, phenolic group of tyrosine, or phenylalanine residues within the cyclase active site.
In order to clarify the mechanism of D ring expansion, the highly conserved aromatic amino acid residues in oxidosqualene cyclase, site-saturated mutagenesis experiments on phenylalanine125 residue of
Pisum sativum(PSY) oxidosqualene cyclase which synthesis β-amyrin were
carried out and then compare with the methionine105 residue of
Saccharomyces cerevisiae oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7).
The protosta-20,24-dien-3β-ol products were isolated from the ERG7 M105G/A/S/N/Q/K mutants. This result indicated Met105 plays a catalytic role in the influence of rearrangement process and determination of deprotonation position but does not involve intervention in the cyclization steps. The function of Phe125 in Pisum sativum oxidosqualene cyclase is to stabilize the enzyme structure for movement of products.
誌謝
在經過了兩年專精於生物科技的研究以及外派一年於科管所的學習生涯之中， 隨著時間的流逝，學習到的不僅僅是研究想法與知識而已，還學習到人與人彼此間 相處的道理；社會正是人類所組成的，在人與人的相處之間，有著知識的交流、研 究的傳承、以及情感上的流轉。而在吳老師實驗室的這三年，不論是開心、快樂、 悲傷、辛苦、生氣，最終都將在這本論文之中畫下句點，並且永存回憶之中；我很 開心能夠在實驗室與這三年之中經歷這一切的ㄧ切，因為不論好壞，都是深刻與美 好的回憶。 首先，我一定要感謝在我心目中最帥的老師吳東昆，他總是在研究上給我十分 多的建議，並且讓我在研究上不會有經費的隱憂，因為做研究實在是很花錢的，如 此一來可以讓我放心的去做研究，運用良好的實驗環境以及研究儀器去證明自己的 研究想法；說到這裡也要特別感謝美麗的師母賴美伶，不僅僅是因為在系辦辛勞的 幫我們處理系上事務，也因為她對於老師無微不至的照顧與陪伴，使得老師在經歷 過一些手術之後都能迅速的復元，迅速的投身研究行列，關心我們的實驗，並且讓 老師都能擁有好心情以及那靈活逗趣的眉毛！ 接下來要感謝的是李耀坤老師、刁維光老師、林敬堯老師和鄭建中老師，十分感謝 你們百忙中抽空幫我們審核口試、論文，不論是和藹可親的主持人的李耀坤老師亦 或是傳說中大砲的鄭建中老師，都提供很多有利的建議，讓這本論文更加完善，使 我感受到身為學術界的人，必當對研究盡心盡力，也許日後學生並非投身於學術界， 但是，我想對於任何事物都必須要有這樣的精神，必會謹記於心。 接下來感謝實驗室中永遠的燈塔程翔學長，在我的印象中，你對於學術總有著 源源不絕的熱情啊！每天早上總是最早抵達實驗室，泡著一杯熱咖啡，津津有味的 看著PAPER，雖然可能因為必須有著學長的高度，對於下面的人管理才會比較方便， 所以導致我們沒有很熟識，但是，並不會因為如此而有損於你在我心中的地位；而 媛婷學姐則是我研究以及生活上面美麗的天使，擁有著細心的教導、生活上酸甜苦 辣的分享、處理事情上的指導與教誨，除了天使之外我還真想不出其它可以形容的 名詞呢！一時之間還真難以言盡，否則可能會超過論文本文頁數，不如畢業離校之 日咱們再促膝長談。此外也感謝豪哥對於GC-Mass 上面的維護，因為如此才能使我 在實驗上能夠順利的進行；感謝平常很認真很認真默默做實驗的文鴻學長，因為你 那擁有安全感的肚子以及實驗上的努力，讓我看到了台灣人的精神；感謝最傑出的 運動員晉源學長，正因為天使有了你的陪伴，才顯得喜樂，不再孤單孤獨。感謝裕 國學長，在一同郊遊的期間，讓我了解到，原來還有人和我一樣擁有赤子之心，瀑 布也敢爬，我想學長在實驗上也勇於突破別人所不敢突破的屏障。感謝小紅和宅宅 兩夫婦在實驗室中最後的這一段日子當中，帶給我歡樂與喜悅，使我有了看盡天下 III事、一笑泯恩仇般開闊的心胸，這對於我未來人生的道路，想必是重要的基石。感 謝Mili 使我知道原來印度人其實人都挺好挺好玩的，我都還記得妳說，妳比較喜歡 我，沒有比較喜歡育勳，哈哈！也感謝Allen 讓我了解到當醫生不是這麼簡單的阿， 尤其是急診室的主任，壓力一定很大。正因為有學長姐們的廣博知識，使我能增廣 見聞，不勝感激。 感謝已經畢業的采婷學姐、文祥學長、文暄學姐、皓宇學長，在剛進實驗室的 期間，有妳們的細心教導與帶領，使我對於OSC 的研究領域更加熟悉。此外也感謝 小高學長，在我剛進入實驗室的這段時間，使我能迅速的熟悉並且融入實驗室當中。 再來感謝陪伴我一起奮鬥的同學們，亦諄讓我體會到在人生中有時傻傻的幸福 也是很美好的，並且在實驗中我們也相互的扶持；育勳那傻呼呼的硬頸精神，讓我 了解到擁有客家人血統的可敬之處；感謝禕庭能陪我度過那段傷心的時光、採買的 時光、玩樂的時光與增肥和減肥，並且讓我充分了解到什麼才叫做工作狂。有了這 些好同學，証明除了考上交大進入吳老師實驗室之外我運氣可真好呢！ 接下來感謝那些可愛的學弟妹們：感謝呂靜婷讓我在諧星的路上並不孤單，搞 笑的時候永遠有妳的陪伴；感謝小花那罐蜆精，使我成為好肝好腎的好男人；感謝 涵涵讓我充分了解到身為天秤座那色大膽小的一部分；感謝一起將我的口頭禪發揚 光大。有了你們使我在第三年中也一樣開心歡樂，謝謝你們。 對了還有更小的學弟妹們：感謝欣怡那女王般的氣魄，讓我這幼稚鬼有被摸摸 頭寵愛的感覺；感謝怡臻的請客，讓我飽餐一頓，還有了解到對於時間的要求，因 為在下是個隨興之人，但是我是肯改進的；感謝欣芳那永遠體貼，柔情似水的溫柔， 讓我知道什麼才是真正的小媳婦、小女人阿！感謝世穎能陪著我打球，還有讓我真 正了解到那師範體系孜孜不倦的教育精神，一定要說到你懂的感覺；感謝那被我弄 哭過、弄生氣過的小彥，話說我覺得這還真不簡單啊！有這個性直爽的學妹還挺不 錯的，我會記得妳在蘭嶼爬山爬輸我，還有妳是也敢爬瀑布的愛到處玩的死小孩呢！ 特別銘謝在我寫論文期間陪伴我的小狗狗老康；感謝科管所的老師都能讓我高 分通過，當然這其中包含著報告組員君翰、偉翰、勻薇等人共同的合作，使我在外 系中也不孤獨，且充滿歡樂；感謝我的室友老皮，永遠跟我開些白爛的笑話，還有 在深夜裡打著永遠是最後一場的電動；感謝陪我打球常向我抱怨的威宇哥，因為和 你在一起的時間都是開心的呢；還有…還有那陪伴我到全台各地以及偏遠山區旅遊 的珮如，因為妳的陪伴，使我的研究更有動力、衝勁以及效率。 最後感謝我的父母，正因為有你們才能使我衣食無虞，雖然父母總是會忍不住 碎碎念的，但是我都能明白體會箇中奧妙的，你們真的都是為了我好啊！放心，不 會讓你們失望的。 謹以此文寥寥數語敘述心中之百感千思 IV
目錄
摘要 ... I Abstract ... II 誌謝 ... III 目錄 ... V 圖目錄 ... VIII 表目錄 ... XI 第一章 序論 ... 1 1.1 固醇類的生化角色與重要性... 1 1.1.1 膽固醇在生物體內扮演的生理角色 ... 4 1.1.2 膽固醇的生合成途徑 ... 5 1.2 三萜類環化酵素家族的簡介 ... 8 1.2.1 三萜類產物的多樣性與特異性 ... 9 1.3 氧化鯊烯環化酵素家族的簡介 ... 11 1.4 各物種間多樣性三萜類產物反應機構 ... 15 1.4.1 鯊烯-蛇麻烯環化酵素（SHC） ... 16 1.4.2 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 (OSC) ... 23 1.4.2.1 氧化鯊烯環化酵素受質穩定之假說 ... 24 1.4.2.2 氧化鯊烯環化酵素的環化機制 ... 26 1.4.2.3 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC） ... 27 1.4.2.4 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 OSC 各反應步驟探討 30 1.4.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS） ... 40 V1.4.4 氧化鯊烯-羽扇醇合成酵素與 ß-香桂素合成酵素 (LUP＆ BAS) ... 45 1.5 氧化鯊烯環化酵素之胺基酸序列比對 ... 49 1.6 研究目的 ... 54 第二章 實驗材料與方法... 62 2.1 實驗材料 ... 62 2.1.1 化學藥品與材料 ... 62 2.1.2 實驗套組 ... 65 2.1.2.1 定序套組 ... 65 2.1.2.2 質體取得套組 ... 65 2.1.3 菌珠與載體 ... 65 2.1.4 培養液與緩衝液 ... 66 2.1.5 實驗儀器 ... 70 2.2 實驗方法 ... 72 2.2.1 重組質體的建構 ... 72 2.2.2 酵母菌珠 TKW14C2 與 CBY57 的電穿孔作用 ... 78 2.2.3 功能性補充活性篩選 ... 79 2.2.4 酵母菌的培養 ... 81 2.2.5 非皂化脂質的萃取... 82 2.2.6 管柱液相色層分析... 83
2.2.7 薄層色層分析 ( Thin Layer Chromatography ) ... 83
2.2.8 氣相層析/質譜儀（GC/MS）的條件 ... 84
2.2.9 突變電腦模擬圖的建構 ... 85
第三章 實驗結果與討論... 86 3.1 酵母菌 ERG7 M105F+H234G/A/Y功能性分析 ... 86 3.1.1 建構 ERG7 M105F+H234G/A/Y 的雙點突變株 ... 86 3.1.2 ERG7 M105F+H234G/A/Y突變株功能性補充篩選以及 產物分 析與討論 ... 86 3.2 酵母菌 ERG7 M105X功能性分析 ... 89 3.2.1 建構 ERG7 M105X飽和定點突變株 ... 89 3.2.2 ERG7 M105X突變株功能性補充篩選以及 產物分析與 討論 ... 90 3.3 P.sativum PSYF125功能性分析 ... 95 3.3.1 建構 PSYF125飽和定點突變株 ... 95 3.3.2 PSYF125X突變株功能性補充篩選以及產物分析與 討論 ... 95 第四章 結 論... 102 4.1 酵母菌 ERG7M105F+H234G/A/Y功能性分析 ... 102 4.2 酵母菌 ERG7M105X功能性分析 ... 103 4.3 P.sativum PSYF125X功能性分析 ... 103 第五章 未來展望... 105 第六章 參考文獻... 106 VII
圖目錄
《圖1-1》在不同物種中間的固醇類皆具有相似結構 ... 2 《圖1-2》膽固醇的生合成途徑 ... 7 《圖1-3》三萜類環化酵素在不同物種間的特異性 ... 10 《圖1-4》不同物種間的三萜類環化酵素序列比對樹狀圖 ... 10 《圖1-5》氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物途徑 ... 15 《圖1-6》SHC 的環化機制與 OSC 十分類似 ... 17 《圖 1-7》SHC 之 X-射線晶體結構圖。C：胺基酸的 COOH 端；N： NH2 端；L：抑制劑（LDAO）接合位置；E：酵素表面唯一 的非極性區域，約為 1600Å2 並被認為是受質進入的通道 （Entrance Channel）。紅色與黃色緞帶構形為α-Helix 的結構； 綠色為 β 結構；紫色為 QW-Motifs 之重複區域。 ... 18 《圖1-8》藉由抑制劑 Ro48-8071（灰色）與 SHC 結合的分子模擬圖， 證明 Asp376 為提供質子起始環化反應15 ... 19 《圖1-9》利用 X-ray 推斷 SHC 可能的活性區域32 ... 20 《圖1-10》SHC 活性區域內假設活性胺基酸的位置與功能 36 ... 22 《圖1-11》SHC 各突變點產物分布圖33 ... 23《圖1-12》Johnson 提出的理論模型 Johnson Model38,39 ... 25
《圖1-13》Griffin 所提出的 Aromatic Hypothesis 理論模組 40 ... 26
《圖1-14》OSC 催化氧化鯊烯形成羊毛硬脂醇的環化機制 ... 27
《圖1-15》人類 OSC X-ray 晶體結構，圖中黑色處為抑制劑 Ro48-8071， 用以指出與受質結合的反應活性位置 41 ... 29
《圖1-16》人類 OSC 與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑 Ro48-8071
... 29
《圖1-17》a. 酵母菌 OSC 假設開環環化機制43 b. 人類 OSC 開環
環化機制 45,46 ... 31 《圖 1-18》Trp387、Phe444、Trp581 穩定 A 環與 B 環形成時的 C6、 C10-碳陽離子中間物；Tyr98 的側鏈藉由立體空間障礙促使 B 環形成能量較不傾向的船形結構 41... 32 《圖1-19》利用類似物作為受質結果顯示 C 環會先形成五圓環 ... 34 《圖1-20》Hess 認為 C 環與 D 環會經由過渡態之後同時形成61 ... 34 《圖1-21》具有高度保留性的芳香族性胺基酸 Trp192、Trp230、His232、 Tyr237、Tyr503、Phe521 與 Phe696 可以利用碳陽離子與 π 電 子共振交互作用去穩定甲基與氫化基的骨架重排41。 ... 36 《圖 1-22》氧化鯊烯環化酵素與其產物-羊毛硬脂醇形成複合物的結 構圖。圖中所顯示的胺基酸基團為距離產物在5Å 內的位置， 水分子只有在 Asp456 及 His232 附近被觀察到41。 ... 37 《圖1-23》H234 定點飽和突變的產物 62 ... 39
《圖1-24》Tyr410 (◆), His477 (＊) and Ile481 (▼)在 CAS1 具有高度保
留性而在 ERG7 中則被 Thr、Cys、Gln 或是 Val 所取代70 ... 41
《圖1-25》阿拉伯芥 CAS 定點突變產物結構圖68 ... 44
《圖1-26》酵素催化氧化鯊烯而形成達瑪烯碳陽離子中間物以及原脂
醇碳陽離子中間物 ... 47
《圖1-27》飽合定點突變實驗中 PNY 的 Tyr261H 所產生的三種產物 . 49
《圖1-28》P.sativum 的 BAS、O.Europa 的 LUP、阿拉伯芥（A.Thaliana）
之 CAS、阿拉伯芥（A.Thaliana）LAS、人類（H.sapiens）之
OSC 以及酵母菌（S.cerevisiae）之 OSC 彼此間序列比對。 .... 53
《圖1-29》各物種間氧化鯊烯環化酵素相關性研究圖 ... 56 《圖1-30》BAS 反應機制表示圖 ... 57 《圖1-31》OSC 和 BAS 之間反應機制的差異 ... 57 《圖1-32》BAS 結構模擬圖中 C20 周圍之胺基酸 ... 58 《圖1-33》OSC 的結構模擬圖中 C20 周圍之胺基酸 ... 59 《圖 1-34》飽合定點突變實驗中 PNY 的 Tyr261H 所產生的三種產物 左邊兩種異構產物即可發現尾端長碳鏈的角度是完全不同的， 因此可推論H234 過近的距離所造成的立體障礙會使得在 C20 碳陽離子形成之後有著”甩尾”的動作產生，也關係著下一個 步驟為擴環亦或是重排的反應。 ... 60 《圖1-35》不同物種間的序列比對 ... 61
《圖2-1》QuikChange Site-Directed Mutagenesis 示意圖。 ... 72
《圖2-2》產物分析流程示意圖 ... 82 《圖3-1》M105F+H234G 的 GC-MS 圖譜，有少量的 LA ... 88 《圖3-2》野生型 ERG7 所產生的 GC-Mass 圖譜，有大量 LA ... 88 《圖3-3》M105G GC-MS 之 protosta-20,24-dien-3β-ol 圖譜 ... 92 《圖3-4》吸熱反應以及放熱反應與自由能關係之示意圖 ... 93 《圖3-5》推測產生 protosta-20,24-dien-3β-ol 的反應機制 ... 94 《圖3-6》F125 周圍的胺基酸以及和 F125 的距離 ... 98 《圖 3-7》F125 中苯環的 π 電子雲與 Cys370 上的硫原子拉扯兩者中 間之氫原子的相互作用力 ... 99 《圖 3-8》PSY 結構圖，藍色為受質，橘色為 C370，綠色為 V371， 黃色為包含 C370 和 V371 的 α-helix ... 101 《圖3-9》人類 OSC 結晶結構推測受質進出位置(藍色圓圈部分) ... 101 X
XI
表目錄
《表1-1》阿拉伯芥 CAS 定點突變產物及比例分配表 68 ... 45
《表2-1》飽和定點突變之引子設計 ... 73
《表2-2》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所用材料條件 ... 73
《表2-3》QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit 所使用之聚合酵 素放大步驟 ... 74
《表2-4》Dpn I 酵素切除母股 DNA 產物處理材料條件 ... 74
《表2-5》特定限制酶鑑定之材料條件 ... 76
《表2-6》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 之材料 ... 77
《表2-7》BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit 所用溫度 ... 77
《表3-1》酵母菌 ERG7 M105F+H234G/A/Y功能性篩選與產物分析表 ... 87
《表3-2》酵母菌 ERG7M105F+H234G/A/Y功能性篩選與產物分析表 ... 91
《表3-3》P.sativum PSYF125X功能性篩選與產物分析表 ... 96
第一章
序論
1.1 固醇類的生化角色與重要性
固醇類（Sterols）是多環脂醇類物質的通稱，其組成通常具有四至 六個環作為其結構的中心骨架，並含有一個長短不一且經由不同官能基 修飾之側鏈，同時在其C-3 位置上會有一羥基者稱之。自然界的固醇類 普遍存在於動、植物與細菌中，例如：膽固醇（cholesterol）、麥角固 醇（ergosterol）、β-麥胚固醇（β-amyrin）、植物固醇（phytosterol）以 及其生合成代謝途徑中的上游產物及其衍生物，彼此間皆具有十分相似 的結構《圖1-1》；由於在大多數的真核細胞中，固醇類物質扮演著細胞 膜組成及生理調控的重要角色1，所以固醇類的生合成途徑與其代謝調節 機制一直是近年來十分重要的研究課題。 1《圖1-1》在不同物種中間的固醇類皆具有相似結構 在動物體內，最常見的固醇類物質以膽固醇（Cholesterol）最為重要。 而膽固醇是一種類似脂肪的複合體，主要是由肝臟所製造產生，其次是 在腸、腎上腺皮質及動脈管壁上生成，同時也可經由食物的攝取而獲得 2。膽固醇在動物體內參與了許多新陳代謝相關的生理調控。由於它是細 胞膜的重要成分可以調控細胞膜的流動性，進而影響胞內外物質的滲透。 此外膽固醇亦可藉此調控細胞膜上之蛋白質使其進行訊息傳遞、代謝反 應與催化等作用3。另外，膽固醇也是膽汁、固醇類荷爾蒙、維生素D3、 紅 血 球 與 其 它 五 種 固 醇 類 激 素 的 重 要 前 驅 物 ， 如 ： 糖 皮 質 固 醇 （ Glucocorticoids ） 中 的 皮 質 醇 （ Cortisol ） 、 礦 物 皮 質 固 醇 2
（Mineralocorticoids）中的醛固酮（Aldosterone）、雄性激素（Androgens）、 雌激素（Estrogens）與黃體酮（Progestins）。人體也可利用膽固醇，自 行合成脂溶性維生素D3，而維生素D3 是一種具有激素功能的固醇，會 影響鈣質吸收，進而造成血鈣與骨鈣的回饋循環平衡，並刺激基因表現 與增加骨質的密度4。此外，膽固醇也是脂質筏（Lipid raft）的組成成分。 Lipid raft 是指細胞膜中一塊固性區域，當細胞膜上膽固醇比例增加時， 細胞膜的流動性會減少，即一塊較不具流動性的富含膽固醇的區域5。許 多文獻的研究也指出，脂質筏可能與訊息傳遞、發炎反應、細胞移動
（Migration）、神經傳導等反應有關，如：阿茲海默症（Alzheimer’s disease）
等6。此外，在酵母菌的實驗也發現，部份具特定結構的固醇類，以及其
相對應的激素，對於細胞分裂中增生週期的調控，有密切的相關性。因
此，固醇類及三萜類天然物在酵母菌、動、植物細胞一直被廣泛注意7,8。
1.1.1 膽固醇在生物體內扮演的生理角色
膽固醇在體內的運送需要藉由與脂蛋白結合的方式來運送，主要 可分為三種脂蛋白： (1) 非常低密度脂蛋白- 膽固醇（VLDL-cholesterol），負責從肝臟中將 脂質攜帶至全身各組織，同時VLDL 也會轉變為 LDL (2) 低密度脂蛋白- 膽固醇（LDL-cholesterol），將膽固醇運送至全身各 部位，但若含量過高的會對人體不利，是造成血管阻塞、硬化的元凶 (3) 高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-cholesterol），可將黏在血管上多餘的膽 固醇運送回肝臟進行代謝排除，以降低血液中總膽固醇的含量。另外藉 內每日飲食所攝食的脂肪，經由腸胃道吸收而形成的乳糜微粒 簡單來說HDL 對人體來說是好的膽固醇；而在人體受到自由基攻擊 時，或處於高氧化壓力的情況之下，血液循環中的 LDL 會被修飾，也 就是進行乙醯化作用或其LDL apoB （LDL apolipoprotein B，低密度脂 蛋白表面脂蛋白 B）會被氧化而形成 ox-LDL（氧化型低密度脂蛋白）， 使其失去攜帶膽固醇之能力，進而引起高血壓、心臟病、動脈粥狀硬化、 中風……等心血管疾病的發生 9-11。另外，在黴菌中，固醇類生合成途 徑的最終產物－麥角固醇(Ergosterol)為黴菌胞膜上的重要組成，也是不 4可或缺的存活因子。因此，目前許多先進的分子生物學技術已被大量用 來研究生物體中固醇類及三萜類天然物的重要性，了解其代謝上的反應 途徑，用以發展降膽固醇及抗黴菌的藥物12,13。
1.1.2 膽固醇的生合成途徑
自然界固醇類的生合成，是由兩個碳的乙醯輔酶-A（Acetyl-CoA） 開始合成，在經由幾個步驟的反應縮合後，利用其速率決定步驟－3-羥 基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶（HMG-CoA reductase）的催化而形成二 羥甲基戊酸（Mevalonic acid），之後再經一連串的ATP水解參與反應， 進而生成異戊二烯類的中間物（Isoprenoid intermediates），隨後六個五 碳的異戊二烯單元體經過縮合及還原反應形成二萜基焦磷酸鹽（geranyl pyrophosphate）與三萜基焦磷酸鹽（farnesyl pyrophosphate）最後產生疏 水性的鯊烯（Squalene）。鯊烯經氧化代謝生成的氧化鯊烯，會經由環 化及一連串反應，進而合成其最終產物14。值得注意的是，在不同物種 間，生物體會分別利用鯊烯或氧化鯊烯作為其環化起始物。例如，在細 菌 或 一 些 原 核 生 物 及 低 等 植 物 中 它 們 會 利 用 鯊 烯 環 化 生 成 蛇 麻 烯 （Hopene），而高等植物、真菌、動物等則會由氧化鯊烯進行環化，並 經一連串反應而生成植物固醇、麥角固醇、膽固醇等固醇類的產物《圖 51-2》。
以 往 在 降 膽 固 醇 的 藥 物 研 究 方 面 ， 主 要 是 著 重 於 以 HMG-CoAReductase做為抑制劑的研究對象，也就是Statins，例如說： Atorvastatin 、 Fluvastatin 、 Lovastatin 、 Pravastatin 、 Rosuvastatin 、 Simvastatin都是這類的藥物，然而此一方式卻會影響其下游產物異戊二 烯中間物與三萜類化合物的生成，進而影響具有重要功能的二次代謝物 的生成與調節。由於固醇類生合成代謝途徑中的環化酵素－氧化鯊烯環 化酵素（Oxidosqualene Cyclase；OSC）位於整個反應的中下游《圖1-2》， 若由此處做為研發抑制物的研究標的，對身體的副作用理論上會相對較 小，故近年來OSC已逐漸成為抗黴菌及降膽固醇藥物的研發目標15。 此外，由於此環化酵素的環化反應，涉及了包括十幾個鍵的斷裂、形成 及碳骨架的重排、去質子化等步驟(終止脫除反應)，如此高度複雜且極 具效率的環化反應，更強烈地引發我們想去探究的興趣。 6
《圖1-2》膽固醇的生合成途徑
1.2 三萜類環化酵素家族的簡介
三萜類化合物（Triterpenoid）是一群由三十個碳的前驅物衍生而來 的多烯類產物。目前，已知天然來源而產生的不同多烯類骨架的三萜類 化合物有近兩百多種16。這些三萜類化合物，主要是由自然界的三萜類 環化酵素家族，經由單一步驟的酵素催化反應，並藉由酵素與受質間的 鏡像或立體選擇性的環化及骨架重排作用，而生成了如此多樣的產物， 而這些產物泛存於自然界的各物種中形成產物多樣性。然而，正因為此 一催化反應的複雜性與其產物的多樣性，三萜類環化酵素家族對於其催 化鯊烯（Squalene） 或氧化鯊烯（(3S)-2,3-oxidosqualene） 進行環化反 應， 而形成多環多烯類（terpenes）的催化機制在這半世紀以來一直是 分子生物學家及化學家所公認是最迷人的生物轉化反應之一。 三萜類在不同物種間依其之酵素，能分別將直鏈狀多烯類的鯊烯或 氧化鯊烯，經由單一生物轉化的過程，催化形成多個不對稱立體中心的 多 環 類 脂 醇 或 三 萜 類 化 合 物17。 整 個 環 化 過 程 包 括 雙 鍵 或 環 氧 鍵 （Epoxide）的質子化（Protonation）、誘導開環、環化（Cyclization）、 甲基與氫化鍵之重組（Rearrangement）、與最後的終止脫除（Elimination） 反應。 81.2.1 三萜類產物的多樣性與特異性
三萜類化合物依物種的特異性會分別利用不同之環化酵素來進行三 萜類的環化反應。例如在細菌中，直鏈狀的鯊烯會經由鯊烯-蛇麻烯環化 酵素（Squalene - Hopene Cyclase；SHC）的環化作用而生成具有五環的
產物－蛇麻烯（Hopene），或藉其他環化酵素的反應而生成蛇麻醇
（Hopanol） 或里白醇（diplopterol） 等環狀產物；在較高等的植物與 藻類中，氧化鯊烯可以被環阿屯醇合成酵素（CycloartenolSynthase；CAS） 環化而生成五環之環阿屯醇（cycloartenol），或是經由羽扇醇合成酵素 （Lupeol Synthase；LUS） 的作用而合成五環的羽扇醇（Lupeol），亦 可以被香桂素合成酵素（Amyrin Synthase；AMS） 環化而形成五環的α-香桂素（α-Amyrin）或 ß-香桂素（ß-Amyrin），又或藉其他環化酵素環 化而形成不同的四環至六環的產物；而在動物、真菌與其它甲基營生菌 （methylotrophic bacterium）中， 氧化鯊烯- 羊毛硬脂醇環化酵素 （Oxidosqualene-Lanosterol Cyclase；OSC） 則會將氧化鯊烯環化形成 四環之羊毛硬脂醇（Lanosterol；LA）。這些具有物種專一性的環化產 物，可分別依反應的產物骨架的複雜性進而區分為6-6-6-5 四環、 6-6-6-6-5 五環、6-6-6-6-6 五環或其它單環、雙環、三環與六環的三萜 類化合物16《圖1-3》《圖1-4》。 9
《圖1-3》三萜類環化酵素在不同物種間的特異性
《圖1-4》不同物種間的三萜類環化酵素序列比對樹狀圖
1.3 氧化鯊烯環化酵素家族的簡介
氧化鯊烯環化酵素屬於自然界三萜類環化酵素家族的一類，包含許 多環化酵素，如：氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）、氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）、羽扇醇合成酵素（LUS）、香桂素合成酵 素（AMS）等。主要是利用氧化鯊烯（Oxidosqualene；OS）作為其反 應受質，並催化其進行複雜的生物轉換反應進而生成下游的二次代謝產 物的前驅物，如：固醇類、膜組成物、固醇類激素或其他二級代謝物。 對於氧化鯊烯環化酵素的研究已經行之有年。1970 年，Robinson發 現酵素必須將受質的碳原子折疊在膽固醇結構的相似位置才可進行催化反應18。Bloch 與Cornforth 則利用混入實驗（incorporation）直接証
明了在羊毛硬脂醇合成反應機制中，酵素具有催化甲基與氫化基轉移的 骨架重排反應的能力19。而Corey 與Bloch 則進一步証明了哺乳類中其 氧化鯊烯環化酵素合成羊毛硬脂醇的反應受質是2,3-氧化鯊烯而非鯊烯 20。Barton 則更進一步証明真核生物是利用3(S)-2,3-氧化鯊烯做為其環 化的反應受質，而非3(R)的鏡像異構物21,22。另外，Corey 藉由合成氧化 鯊烯環化酵素所催化生成的可能中間物，探討此單一步驟高效率的生物 轉化，如何將不具立體中心的氧化鯊烯環化生成具多個不對稱立體中心 11
的反應機制23。而Ruzicka 與其研究團隊，也利用生命期短以及離子性 的中間物，建構出立體化學的假說23。同時，Corey 和Matsuda 也以實 驗証明環氧基的親電性活化開環，及需要酸性基團作為其質子供應者以 誘導活化開環24,25。 在先前的研究中指出，若將鯊烯置於中性或是弱酸的溶液中，在室 溫下可穩定地存放一天，因此強酸被認為是在開環的起始反應中所必需 的24。而突變實驗也證明了胺基酸Asp在氧化鯊烯環化酵素家族中具有高 度保留性並且為催化所必須之胺基酸3。因此，Asp被認為是誘導環氧基 開環的重要基團，可以提供質子進行開環。在環化反應方面，受質經由 受質通道進入酵素以後酵素上的胺基酸基團電子會誘導受質摺疊成適 當結構，再經由酵素上酸性基團Asp誘導開環，過程中會形成許多具有 高能量的碳陽離子中間產物，進而進行環化與骨架重排等反應。最後再 經由酵素胺基酸與受質間的牽引交換，或是藉由水分子的作用以提供氫 氧基來吸引電子，進而形成雙鍵或是由所提供的氫氧基團形成雙醇類產 物而終止反應。目前約有近200種氧化鯊烯環化酵素的產物被報導出來 26,27，這些產物經由類似的催化機制都具有相似的骨架結構，但是由於 酵素活性區域與受質結合區的不同，導致其在環化骨架上的差異，另外 經由甲基與氫化基的重排也會後會產生許多不同的碳陽離子中間產物， 12
最後則依不同的碳陽離子的脫除（cation-quenching）步驟中止反應，進 而形成多樣的產物。 細部來說，整個環化過程中包含了非常多個鍵的斷裂與生成，從一 開始的環化酵素中的酸性胺基酸提供電子，進而使得親核性的雙鍵或是 環氧基藉由其親核性作用進行開環起始反應，接下來經過一連串的碳陽 離子-烯烴環化作用（cation-olefin cyclization）生成帶有正電的高能碳陽 離子中間產物（cationic intermediates）。而大部分的碳陽離子中間產物 皆只存在於十分短暫的時間，所以並不容易被科學家所分離。此外，鯊 烯在其環化酵素的活性區域中，會依全椅形的形式（all-chairform）摺疊， 而相對地氧化鯊烯在不同的氧化鯊烯環化酵素活性區域中，經由不同物 種的環化酵素上胺基酸殘基的誘導，則會有兩種摺疊的方式：椅形-船形 -椅形（chair-boat-chair）與椅形-椅形-椅形（chair-chair-chair），依這些 摺疊方式來進行上述開環反應進而形成碳陽離子中間產物3。正因為相同 的反應受質在酵素中具有不同的摺疊方式，所以造成了立體構形相異的 反應機制，經質子化及一連串的雙鍵電子轉移後，會生成二種類型的碳 陽離子中間物如：（一）經由chair-boat-chair 骨架摺疊生成的原脂醇碳 陽離子中間物（Protosteryl cation intermediates）；（二）經由chair- chair –chair骨架摺疊會形成達瑪烯碳陽離子中間物（Dammarenyl cation
intermediates）。其中原脂醇碳陽離子中間物經過不同的甲基與氫化基 的轉移等骨架重排作用後，會在不同位置進行脫氫反應，或是藉由水分 子作用來終止反應進而形成環阿屯醇、羊毛硬脂醇和南瓜子雙烯脂醇 （Cucurbitidienol）；而達瑪烯碳陽離子中間物在不同酵素中可以被繼續 誘導環化而形成6-6-6-6-5 及6-6-6-6-6 五環的碳陽離子中間物，接著再 經由類似的骨架重排與脫氫作用而生成達瑪雙烯醇（Dammaradienol）、 羽扇醇、α-香桂素及ß-香桂素等28-30《圖1-5》。 14
《圖1-5》氧化鯊烯在酵素內的摺疊方式與其產物途徑
1.4 各物種間多樣性三萜類產物反應機構
接下來就對於鯊烯-蛇麻烯環化酵素（Squalene - Hopene Cyclase； SHC）以及各種不同物種氧化鯊烯環化酵素的研究作介紹
1.4.1 鯊烯-蛇麻烯環化酵素（SHC）
在自然界中，細菌與原生動物並不會產生固醇類，而是以五環的蛇 麻烯作為替代。細菌中的鯊烯-蛇麻烯環化酵素（Squalene-Hopene；SHC） 與OSC、CAS同樣屬於三萜類環化酵素家族，而SHC也與OSC具有類似 的環化機制《圖1-6》。從受質的觀點來看，真核細胞的氧化鯊烯環化酵 素利用氧化鯊烯作為受質，而細菌的鯊烯環化酵素則是利用鯊烯作為受 質，所以鯊烯環化酵素被認為出現在演化過程中較早的厭氧時期。另外， 細菌的鯊烯環化酵素對受質的專一性也較低，不僅可以利用鯊烯作為受 質，對於氧化鯊烯或是其光學異構物甚至是一般的多萜醇也可以進行反 應。相反地，真核的氧化鯊烯環化酵素則具有很高的受質結構專一性。 若從環化機制上來觀察，鯊烯環化酵素在反應機制和形態上都是以較簡 單的方式進行。當它在進行環化作用時，受質會以較穩定的”椅形-椅形-椅形”的結構存在，這使得受質需要的酵素助力較小，而在細菌的鯊烯 環化酵素中，也不具有最後的骨架重排步驟。 16《圖1-6》SHC的環化機制與OSC十分類似 在所有三萜類環化酵素中，A.acidocaldarius 鯊烯-蛇麻烯環化酵素 (SHC, EC5.4.99.x)是最早被結晶出來，並且於1997年Science期刊中發表 其X-ray晶體結構、酵素蛋白的活性區域與可能的反應機制31。從其結晶 結構上可以發現SHC是一個啞鈴型雙聚體膜蛋白，結構中含有豐富的α 螺旋（α-helix）。雖然SHC為膜蛋白，但它並未完全穿透細菌的細胞膜， 其受質鯊烯會經由疏水性的孔道進入酵素的活性區域中《圖1-7》。這些 結構的資訊，可用作其它同源性環化酵素家族的基本模版，並且提供反 應機制與酵素結構功能的研究方向。另外，A.acidocaldarius的SHC與人 類OSC的重要胺基酸約有20% 相同性（Identity），並由於其具有同源 性，因此可以透過SHC結構上的相關資訊，來推測OSC的環化過程的機 制。 17
《圖1-7》SHC之X-射線晶體結構圖。C：胺基酸的COOH端；N：NH2 端；L：抑制劑（LDAO）接合位置；E：酵素表面唯一的非極性區域， 約為1600Å2並被認為是受質進入的通道（Entrance Channel）。紅色與黃 色緞帶構形為α-Helix的結構；綠色為β結構；紫色為QW-Motifs 之重 複區域。 1998 年 Abe 等 人 曾 經 利 用 固 醇 類 抑 制 劑 Ro48-8071 來 研 究 A.acidocaldarius中SHC其酵素結構與催化功能的相關性15。從Ro48-8071 在A. acidocaldarius的SHC之X-射線晶體結構中與酵素相結合的活性區 域位置，以及藉由之前酵素動力學之實驗數據，並可以用來證明SHC與 Ro48-8071間的抑制關係，可以發現胺基酸Asp376在酵素中扮演著誘導 18
雙鍵打開質子化的角色，並且會與His451間產生氫鍵作用，另外若加上 Tyr495和Asp376與水分子的互相聯繫，增強Asp376所扮演的路易士酸來 協助起始環化反應的角色《圖1-8》。 此外，在2004年Schluz等人利用2-azasqualene當作抑制劑來研究A. acidocaldarius SHC，更從其中推斷可能的活性區域32《圖1-9》 《圖1-8》藉由抑制劑 Ro48-8071（灰色）與SHC結合的分子模擬圖，證 明Asp376為提供質子起始環化反應15 19
《圖1-9》利用X-ray推斷SHC可能的活性區域32
綜合SHC的結晶結構與定點突變的實驗結果33，可以提供我們足夠的
證據，來了解酵素在催化反應進行時，活性區內胺基酸與受質鯊烯的交
互作用33。其中具有芳香族基團特性的胺基酸Trp312與Trp169，被認為 可能是與受質的辨識鍵結有關，而Wendt等人則認為這兩個胺基酸會利 用其碳陽離子-π電子的交互作用分別穩定C-4與碳C-13（Hopene編號） 的碳陽離子中間物《圖1-10》34,35。同樣地，Trp489也被認為會利用其碳 陽離子-π電子的交互作用穩定A環的形成36。從結晶結構來看，儘管 Tyr609的位置在C-8附近，但Tyr420仍然被認為具有穩定C-8碳陽離子中 間物的功能。因為在定點突變的實驗中，將Tyr420突變成Ala與Gly時， 會得到雙環與三環的產物；另外，Tyr420也被認為會利用其立體空間的 結構來幫助蛇麻烯骨架在B與C環的結構中進行排列37。在酵素SHC中的 Phe605位置除了在空間中十分靠近E環外，其在所有的SHC也具有高度 保留性，然而在OSC並不具有這個胺基酸，所以Phe605被認為是蛇麻烯 E環形成的關鍵35。根據上面的推論也進行了一系列的定點飽和突變的研 究33，而結果如《圖1-11》 21
《圖1-10》SHC活性區域內假設活性胺基酸的位置與功能36
《圖1-11》SHC各突變點產物分布圖33
1.4.2 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素 (OSC)
在氧化鯊烯環化酵素家族中，存在於真菌類與動物中的氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素其主要負責催化受質氧化鯊烯進行環化反應而形 成四環的羊毛硬脂醇，進而代謝形成重要的生理物質麥角固醇與膽固醇。
在酵母菌（Saccharomyce scerevisiae）中，S.c. ERG7是一種由ERG7基因
所轉譯出來的膜蛋白，由2,196個鹼基對轉譯而生成731個胺基酸序列，
而其理論蛋白質分子量為83.7 kDa。正因為此酵素與膜結合的特性，再 加上其分子量很大，因而造成酵素在純化上十分不易，至今尚未有結晶 結構被解析出來，也因此在其結構與催化機制方面的探討仍然有限。目 前在對ERG7環化反應機制的研究方面，主要是利用分生技術及反應受 質類似物進行探討，通常會透過以下三種方式： （1）利用氧化鯊烯的類似物來取代受質進行環化機制的研究。 （2）比對不同物種之羊毛硬脂醇環化酵素之蛋白質序列與基因選殖， 從得到的序列資訊進行結構與機制上的探討。 （3）以定點突變的方式來研究酵素上某些胺基酸基團在環化機制上 所扮演的角色。 而這三種方法中又以第三種最為普遍，經由突變實驗所得到的新產 物可以讓科學家藉此推測環化過程中胺基酸的催化功能。
1.4.2.1 氧化鯊烯環化酵素受質穩定之假說
針對OSC的受質專一性和反應的立體化學等特性，有兩種假說被提 出來，用以說明酵素是如何穩定這些具有高能量的碳陽離子中間產物。 1987年，Johnson提出了第一個理論模型（Johnson Model）《圖1-12》， 24在這個模型中Johnson認為酵素會利用具相位選擇性（facing selective） 的負電荷來穩定過渡狀態（transition state）的正電高能量的碳陽離子 38,39。 《圖1-12》Johnson提出的理論模型Johnson Model38,39 另外，在1992年Griffin也提出了另一個Aromatic Hypothesis的理論模組40 《圖1-13》。由於在氧化鯊烯環化酵素中，具有芳香族基團的胺基酸Tyr、 Trp與Phe在各物種中皆具有高度保留性，因此Griffin認為這些基團會利 用碳陽離子-π電子作用（cation-π interaction）的穩定效應，來引導受質 進行適當的骨架摺疊並且穩定具有高能量且帶正電的中間產物，使其之 後的甲基與氫化基可以做適當的轉移重排。 25
《圖1-13》Griffin所提出的Aromatic Hypothesis理論模組40
1.4.2.2 氧化鯊烯環化酵素的環化機制
氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素的環化機制包含了數個步驟，並且會 產生許多高能量的碳陽離子中間物。首先，酵素會誘導受質(3S)-2,3氧化 鯊烯在活性區域摺疊成椅形-船形-椅形（chair-boat-chair）的構型。接著 酸性胺基酸Asp455（human OSC）會提供質子來誘導環氧基進行開環反 應，進而引起電子的轉移環化而形成A至D環，最後碳陽離子會落在C-20位置上而形成原脂醇碳陽離子中間物（Protosteryl cationic intermediate）。
最後經過甲基與氫化基的轉移後，酵素會藉由鹼性胺基酸或是與水的交 互作用進行脫氫反應而形成最終的產物羊毛硬脂醇《圖1-14》。
《圖1-14》OSC催化氧化鯊烯形成羊毛硬脂醇的環化機制
1.4.2.3 人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素（OSC）
人類氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素之X-ray晶體結構已經被Thoma 等人在2004年解出，發表於當年的Nature期刊中41。由於OSC結構的確定 《圖1-15》，使得學者得以對於酵素活性區域以及其胺基酸基團可能參 與的反應機制有更進一步了解，並且可以利用人類OSC的結晶結構做為 模版，提供結構與反應機制等相關訊息，來研究不同物種裡面的氧化鯊 烯環化酵素。 27由人類OSC的結晶結構中可以得知，此酵素位於膜的部分有一個直 徑約25Å的通道，此通道被認為是受質氧化鯊烯進入疏水性活性區域的 入口，並且會對活性區域具有分隔的作用。此受質通道會藉由其環狀區 域胺基酸516~524區域與697~699區域的重排作用，或是藉由Tyr237、 Cys233及Ile524等胺基酸其側鏈構形的改變來形成《圖1-16》。 28
《圖1-15》人類OSC X-ray晶體結構，圖中黑色處為抑制劑Ro48-8071，
用以指出與受質結合的反應活性位置41
《圖1-16》人類OSC與膜結合時的構形，圖中黑色為抑制劑Ro48-8071
結合在中心反應的活性結合區41
1.4.2.4 氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素OSC各反應步驟探討
（一）開環起始反應在人類OSC的結晶結構尚未被解析出來之前，科學家多藉由透過受 質類似物與OSC做親和性標定（Affinity labeling），或以定點突變的方
式來推測反應機制42。1997年，Corey等人利用一系列的丙胺酸定點突變
式掃瞄法（alanine scanning site-directed mutagenesis）針對酵母菌ERG7 的活性區域內高度保留性的胺基酸進行實驗，實驗結果顯示酵母菌 ERG7中His146、His234、Asp456位置在催化機制上扮演十分重要的角 色25,43。這些研究認為ERG7在催化環氧基開環反應時，His146會藉由氫 鍵拉扯效應來增強Asp456的酸性，進而提供質子促使環氧基質子化而開 環《圖1-17a》44。同樣地，由人類OSC的X-ray結晶結構可以發現，Cys456 和Cys533兩者皆與Asp455間有氫鍵連結，可藉此增強Asp455的酸性以誘 導環氧基的質子化開環，同時Asp455還可透過與水分子及Glu459的羧酸 基團作用，或是藉由最後脫氫步驟的質子轉移而再質子化《圖1-17b》45,46。 另外有許多研究也相信，在經由質子化開環反應後，會同步引起A環的 環化形成，這兩個步驟目前為止被認為是同步發生的47-51。 30
《圖1-17》a. 酵母菌OSC假設開環環化機制43 b. 人類OSC開環環化機制45,46 （二）環化的過程 早期在環化機制尚不清楚的時候，Matsuda等人在研究B環形成時發 現在酵母菌ERG7內的胺基酸Val454位置具有高度的保留性。同樣的， 對應到植物CAS的Ile481位置亦然。所以他們利用分子生物學的方法將 Val454突變成同為疏水性胺基酸的Phe、Leu與Ile，還有立體空間較為簡 單的Ala與Gly。實驗的結果顯示在Ala與Gly的突變中，會得到單環的產 物，所以他們認為Val454會藉由其立體空間較大的側鏈來幫助B環的形 成52。 在2004年Nature所發表的人類OSC結晶結構中，Thoma等人指出幾個 具有高度保留性的胺基酸位置，其中Trp387、Phe444與Trp581（對應到 酵母菌ERG7分別為Trp390、Phe445與Trp587）會利用其含有苯環的側 31
鏈，並透過碳陽離子-π共振交互作用來，穩定形成A環與B環時產生的 C-6和C-10的碳陽離子中間產物。然而，在酵母菌ERG7 Phe445的定點突 變實驗裡，卻得到了三環與在不同地方去質子化的四環產物。這也證明 了在酵母菌ERG7中，Phe445會影響在C環形成時的C-14碳陽離子中間物 與最後在C-8/C-9的去質子化步驟53。另外，在B環形成時，能量較不傾 向的船形結構方面，Thoma認為Tyr98位置其立體空間較大的側鏈推動氧 化鯊烯C-10上的甲基至到分子平面之下，而進一步地阻礙B環形成能量 較傾向的椅形構形《圖1-18》41。 《圖1-18》Trp387、Phe444、Trp581穩定A環與B環形成時的C6、C10-碳陽離子中間物；Tyr98的側鏈藉由立體空間障礙促使B環形成能量較不 傾向的船形結構41 32
在酵母菌ERG7胺基酸Trp390位置的飽和定點突變實驗結果中，果真
發現了單環的Achilleol A以及Camelliol C，這也證實了人類OSC中
Trp387是來穩定A環形成時的C6碳陽離子中間物；而在酵母菌ERG7胺基 酸Trp587位置的飽和定點突變實驗結果中，則有所不同，在產物分析後 得到除了相同芳香族的胺基酸之外其餘皆沒有產物的產生，證明了這個 點是利用芳香族的胺基酸上的π電子雲來進行受質的辨認54 不過在酵母菌ERG7胺基酸Tyr99位置的飽和定點突變實驗結果中， Tyr99已被證實是與C-14碳陽離子的穩定有關，在此位置進行突變則會 得 到 665 三 環 的 產 物 (13αH)-isomalabarica-14E,17E,21-trien-3β-ol 、 (13αH)-isomalabarica-14Z,17E,21–trien-3β-ol與羊毛硬脂醇等產物55。 1995年，Corey等人在以20-oxaoxidosqualene取代氧化鯊烯作為受質 的實驗中，發現除了6-6-6-5的四環產物以外還有6-6-5的三環系統產物。 所以他們藉此結果推測，在C環形成的過程中會先形成五圓環，再經由 擴環反應而成為六圓環《圖1-19》56,57。另一方面，利用電腦模擬所作的 理論能量計算方面，也認為C環的環化過程會先形成五圓環再行擴環作 用成為六圓環48；Hess則從他的計算結果認為6-6-5的三環碳陽離子中間 物為環化過程中的第一個中間物，而之後C環與D環的形成會經由過渡 態之後同時發生，並非為先前所認為的會先形成六圓環的C環再行擴環 33
作用而產生《圖1-20》58,59。另外Gao在其以SHC為受質的理論計算的研 究中，則是認為在整個環化過程中只會生成單環與雙環的碳陽離子中間 物，其C、D與E環都是同時形成的60。 《圖1-19》利用類似物作為受質結果顯示C環會先形成五圓環 《圖1-20》Hess認為C環與D環會經由過渡態之後同時形成61 34
在人類OSC的結晶結構中，His232與Phe696被認為它們可以藉由其 胺基酸側鏈上所富含π電子的特性，來穩定形成C環時依反-馬可尼可夫 （anti-Markovnikov）法則產生二級碳陽離子，並且可以利用碳陽離子-π 共振作用來穩定帶有正電荷的高能C-20碳陽離子中間物。然而在酵母菌 ERG7 胺 基 酸 His234 位 置 的 定 點 突 變 實 驗 中 ， 也 發 現 了 (13RH)-isomalabarica-14(26),17E,21-trien-3β-ol的三環產物62；在酵母菌 ERG7胺基酸Phe699位置的定點突變實驗中，除了發現三環的相關產物 以外，還發現了在不同位置脫氫的產物，這結果顯示Phe699也會對C-17 碳陽離子有所影響63。最後氧化鯊烯一連串的環化步驟會終止在五圓環 的D環所形成的C-20原脂醇碳陽離子，這是因為OSC缺少像SHC中 Trp169與Phe605的芳香族性官能基，因此無法藉由其π電子來穩定C-17 二級碳陽離子中間物使其有較長的生命期，而能更進一步的環化形成E 環。 （三）骨架重排與脫氫反應 在環化反應結束之後，酵素會藉由其活性內許多具有高度π電子性質 的芳香族基團之胺基酸（如Trp192、Trp230、His232、Tyr237、Tyr503、 Phe521與Phe696等），透過碳陽離子-π電子的共振作用來穩定甲基與氫 35
化基的轉移重排，使得C-20四級原脂醇碳陽離子順利轉變成為C-8/C-9 碳陽離子中間物《圖1-21》3,41。在整個骨架重排過程結束之後，於人類 OSC中，具有高度保留性的胺基酸His232（對應到酵母菌ERG7為His234）， 由於其鹼性殘基十分靠近C-8/C-9碳陽離子，所以被認為是能夠接受質子， 並進而進行整個環化機制的最後步驟－脫氫反應的關鍵胺基酸位置。另 外，His232除了會透過鄰近的水分子的交互作用去影響催化反應的進行 外，還會與其附近的Tyr503之側鏈上的氫氧基團產生氫鍵互相拉扯作用， 使得His232得以位於脫氫反應的最佳位置《圖1-22》41。 《圖1-21》具有高度保留性的芳香族性胺基酸Trp192、Trp230、His232、 Tyr237、Tyr503、Phe521與Phe696可以利用碳陽離子與π電子共振交互 作用去穩定甲基與氫化基的骨架重排41。 36
《圖1-22》氧化鯊烯環化酵素與其產物-羊毛硬脂醇形成複合物的結構圖。 圖中所顯示的胺基酸基團為距離產物在5Å內的位置，水分子只有在
Asp456及His232附近被觀察到41。
除了人類 OSC 的結晶結構外，His234、Trp232 與 Tyr510 的飽和定
點突變的實驗結果也更進一步的證明了這兩個胺基酸在活性區域內所 具有的功能。在酵母菌 ERG7 中 His234 的定點突變產生了許多在不同 地 方 進 行 脫 氫 反 應 的 四 環 產 物 如 protosta-20,24-dien-3β-ol 、 protosta-12,24-diene-3β-ol 還有 parkeol62,64《圖 1-23》，而 Trp232 也在在 不同地方進行脫氫反應的四環產物產生 protosta-12,24-diene-3β-ol 還有 37
parkeol，這證明這兩個胺基酸在重排以及脫氫反應上佔有重要的一席之 地，不同的是 Trp232 並未涉及影響環化的反應的進行。另外，在 Tyr510 突變成 Ala 的突變點中也發現了 parkeol65,66。綜合以上結果，更加證明 了 His234 在酵母菌 ERG7 活性區域中的功能，除了利用碳陽離子-π 電 子的共振作用穩定甲基與氫化基的骨架重排以外，也會幫助酵素在正確 的位置上進行脫氫反應67。 38
《圖1-23》H234定點飽和突變的產物62
1.4.3 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）
在高等植物的脂醇生合成途徑中，受質氧化鯊烯會由氧化鯊烯-環阿 屯醇環化酵素催化其環化反應物，生成植物固醇的前驅物－環阿屯醇 （Cycloartenol），進一步的代謝形成最終產物植物固醇（Phytosterol）。 在阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）中的環阿屯醇環化酵素（CAS, EC 5.4.99.8）是由759個胺基酸所組成，分子量為86kDa。 氧化鯊烯-環阿屯醇環化酵素（CAS）與氧化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵 素（OSC）在環化的機制上，除了在脫氫的位置不同外，其他地方基本 上均十分相似。兩者都是利用氧化鯊烯作為受質，並且在環化時受質皆 會在酵素活性區內以椅形-船形-椅形的方式摺疊，之後並經過一連串類 似的環化過程而形成C-20原脂醇碳陽離子中間物，並且有相同的甲基與 氫化基轉移機制，只是在進行到最後一步的去質子化步驟時，氧化鯊烯 -環阿屯醇環化酵素會催化C-19上的氫行脫除反應而生成環阿屯醇，而氧 化鯊烯-羊毛硬脂醇環化酵素則催化C-8上的氫脫除而生成羊毛硬脂醇。 另外，學者也發現在兩者的序列比對中，其活性區域內胺基酸基團只有 少數相同，因此這些相異性的位置被認為可能造成兩者脫氫位置不同的 關鍵性胺基酸。所以目前有許多研究就是針對序列比對上在CAS1與 ERG7之間的不同胺基酸序列，利用突變的方式來加以研究其酵素催化 40機制上的相關性34,68。 從熱力學的觀點來看，環阿屯醇比羊毛硬脂醇較為不穩定，所以學 者認為環阿屯醇環化酵素之所以可以將產物環化成為能量較不趨向的 環阿屯醇，可能是因為酵素CAS裡的某些特定胺基酸的作用。而在先前 對阿拉伯芥環阿屯醇環化酵素（AthCAS1）的突變實驗中也發現，Tyr410、 His477與Ile481在CAS環化機制中扮演著十分重要的角色65-68。 這些胺基酸在各物種的CAS中皆具有高度保留的特性，但是在ERG7 中則分別以Thr、Cys、Gln及Val的形式存在《圖1-24》。所以這些胺基 酸被認為會促進環阿屯醇的形成，因此若將這些胺基酸進行突變也可以 得到羊毛硬脂醇69。
《圖1-24》Tyr410 (◆), His477 (＊) and Ile481 (▼)在CAS1具有高度保留 性而在ERG7中則被Thr、Cys、Gln或是Val所取代70
舉例來說，Ile481在所有物種中的CAS皆具有高度保留性，而在ERG7 中則為Val《圖1-24》。根據研究結果顯示，Ile481會藉由其γ位置的甲基 來防止碳陽離子與A環上兩支甲基的交互作用，來促使環阿屯醇的形成。 若將Ile481突變成為Val，在產物中可以得到25%的羊毛硬脂醇與55%的 環阿屯醇和20%的parkeol。另外，Ile481也被認為會利用其較大的立體 空間來幫助受質作正確的摺疊，而如果將其突變成側鏈體積較小的胺基 酸（如Ala與Gly）則會得到achilleol A與camelliol C《圖1-25、表1-1》。 在酵素CAS中，Tyr410與His257被認為在靠近C-19的位置會有氫鍵 配對的交互作用，因此可以藉此幫助最後的去質子化作用69。而在 AthCAS1Tyr410Thr的突變株中，產物會由原本的環阿屯醇變成75%羊毛硬
脂醇、24% 9β-lanosta-7, 24-dien-3β-ol以及1% achilleol A《圖1-25、表1-1》。
另外，若將Tyr410突變成為Thr時，則會減低碳陽離子中間物上方的立 體空間障礙，而且由於Thr上的氫氧基團較Tyr更接近α-碳，因此在
AthCAS1Tyr410Thr突變株中，Tyr532與His257的極性基團將會被重新排列， 因而造成酵素CAS不會產生環阿屯醇，反而會在C-8/C-9部位上進行脫氫
反應而形成羊毛硬脂醇、parkeol 與9β-lanosta-7,24-dien-3β-ol71。
CAS His477雖不位於受質鍵結的活性區域，但是曾有報導指出，位於
活化區外圍（second-sphere）的His477會與Tyr410產生氫鍵的交互作用 42
而互相拉扯，進而影響環化機制的最終脫氫反應69。His477在所有物種 的CAS中皆具有高度保留性，而在ERG7中則會以Gln或Cys取而代之。 在AthCAS1His477Gln的突變株中，帶有極性的官能基會向C-11移動靠近， 造成在C-11位置行脫氫反應而產生parkeol多於羊毛硬脂醇的結果；而在 AthCAS1His477Asn的突變株中，則會產生大量的羊毛硬脂醇，但由於其胺 基酸基團也夠靠近C-11的位置，所以也會產生Parkeol72。 在整個CAS環化過程中，His257與Asp483被認為是CAS催化活性上 所必需。Asp483被認為會作為一個路易士酸來幫助環氧基的開環，以協 助環化的起始作用；His257則被認為是位在活性區域的鹼性基團，能協 助C-19上的氫與活性區上的酸基有一質子的來回移動，以幫助在C-19 位置上的脫氫作用44 。另外在雙定點突變突變株AthCAS1I481V/Y410T中， 發現其產生羊毛硬脂醇的比例比較其他定點突變株高出許多；然而在三 定點突變株（His477Asn/Gln,Ile481Val,Tyr410Thr）中，因為Thr的氫氧 基距離Asn與Gln的氨基過遠，所以並沒有辦法促進羊毛硬脂醇的生成。 而經實驗的結果證實，產生羊毛硬脂醇效率最好的突變株為雙定點突變 株AthCAS1H477N/I481V《表1-1》72。 整合上述在植物CAS中的定點突變可以發現，在AthCAS1H477N與
AthCAS1I481V與兩者的雙定點突變株中可以導致植物CAS產生最大量的 43
羊毛硬脂醇。Suzuki等人在2006年時發表了植物羊毛硬脂醇的合成酵素， 他們從阿拉伯芥中發現At3g45130可以在植物中合成羊毛硬脂醇，最後 名為LAS（lanosterol synthesis）。有趣的是從序列比對中可以發現到LAS 在CAS胺基酸His477與I481位置分別被換成Asn與Val，這於CAS中的突 變結果不謀而合，也顯示了這兩個胺基酸對於羊毛硬脂醇合成的重要 性。 《圖1-25》阿拉伯芥CAS定點突變產物結構圖68 44
《表1-1》阿拉伯芥 CAS 定點突變產物及比例分配表 68
1.4.4 氧化鯊烯-羽扇醇合成酵素與ß-香桂素合成酵素
(LUP＆BAS)
天然物中包含了數千種的三萜類的產物，而這些產物大部分來自於 氧化鯊烯環化酵素這個家族，而這些酵素會催化氧化鯊烯而形成達瑪烯 碳陽離子中間物（Dammarenyl Cation intermediates）以及原脂醇碳陽離 子中間物（Protosteryl Cation intermediates），他們分別有不同的立體構 形；而這是從何而來的呢？主要是羊毛硬脂醇環化酵素以及環阿屯醇環 化酵素會將氧化鯊烯折疊成椅形-船形-椅形（chair-boat-chair），進而環
化形成原脂醇碳陽離子，而不同於這兩種酵素的羽扇醇合成酵素（Lupeol Synthase；LUS）以及 ß-香桂素合成酵素會將氧化鯊烯折疊成椅形-椅形 -椅形（chair-chair-chair）《圖 1-26》，進而環化形成達瑪烯碳陽離子中 間物。 這兩種不同的類型影響著如何進行定點突變的實驗，原脂醇碳陽離 子之後形成的產物是固醇類的前驅物，固醇類很早就在自然界的真核生 物中產生所以這類會產生原脂醇碳陽離子的酵素在真核生物中分佈的 十分的廣泛，由於很早就在自然界中產生，所以也經過了很長的演化過 程，在這長久的演化過程之中在兩個不同的羊毛硬脂醇環化酵素之間序 列比對的相同性可以達到非常的低,例如說：trypanosomal 和哺乳類動物 間羊毛硬脂醇環化酵素序列比對相似度只有 30–35%；在研究上的策略 專注於由於這些序列上高度保留性的胺基酸，研究人員可以利用定點飽 和突變方式來研究它們個別的功能 46
《圖1-26》酵素催化氧化鯊烯而形成達瑪烯碳陽離子中間物以及原脂醇 碳陽離子中間物 羽扇醇合成酵素（Lupeol Synthase；LUS）以及 ß-香桂素合成酵素， 會將氧化鯊烯折疊成椅形-椅形-椅形（chair-chair-chair），進而環化形成 達瑪烯碳陽離子中間物的酵素，它們彼此之間的基因序列比對相似度高 達 80%，在比對羽扇醇合成酵素(OEW)和 ß-香桂素合成酵素(PNY)這兩 種基因的差異性發現，在組成酵素的七百多個胺基酸中，彼此間的差異 47
只有 80 個胺基酸，這是因為這兩種酵素都是在雙子葉植物上面所產生 的，而雙子葉植物這種高等的植物是近代才有的，演化時間自然沒有很 長久，所以他們序列上的相似度自然而然十分高；但是，序列比對相似 度高，而其中間產物達瑪烯碳陽離子也相同，卻產生兩種的最終產物， 這使得研究策略上面專注於彼此之間不同的胺基酸殘基而不是有高度 保留性的胺基酸殘基，要研究其功能性，也是使用定點飽和突變方式， 嘗試突變成相對的胺基酸，觀察最後所產生的產物，探討其功能。
根據這種想法 Ebizuka 團隊對於 OEW 和 PNY 彼此間這 80 個不同的胺
基酸進行定點突變的研究，先進行酵素構形的的模擬，找出可能為活性 區域的胺基酸，接下來使用定點突變的方式觀察其產物的差異；發現了 OEW 中的 Leu256 對應於 PNY 中的 Trp259 為這兩個酵素產物特異性的
調控胺基酸73。 因此研究人員將原本產生羽扇醇的OEW中Leu256突變成PNY相對 應的Trp結果產生了高達75%的ß-香桂素，而將原本產生ß-香桂素的PNY 中 Trp259突變成相對應的Leu，所產生的羽扇醇為ß-香桂素的兩倍之多， 藉此確定這個位置的胺基酸為羽扇醇合成酵素和ß-香桂素合成酵素的產 物特異性調控胺基酸。此外還將PNY中的Tyr261突變成OSC相對應的His， 結果產生了三種的產物《圖1-27》。 48
《圖1-27》飽合定點突變實驗中PNY的Tyr261H所產生的三種產物
1.5 氧化鯊烯環化酵素之胺基酸序列比對
從序列比對的結果我們可以知道，各個物種間擁有高度保留性的胺 基酸以及其中差異的胺基酸，而學者們認為這些環化酵素家族催化生成 高度產物的特異性主要是由於下列原因所造成的：（1）有嚴格的反應 機制。反應受質必須結合至酵素上正確的受質結合區，以促使受質排列 成特殊的結構。（2）在環化過程中會產生許多具有高能量的碳陽離子 中間產物。（3）活性區內的芳香族胺基酸會利用碳陽離子-π電子的交互 作用來穩定過渡態的中間產物，因此可以預防早期環化重組的過程被截 斷，以確保產物的順利生成38。 從生物演化的觀點來看，若不同物種間的序列會彼此保留相同的胺 基酸，則此胺基酸可能是在生物體中具備重要功能且不可或缺，所以才 49會在不同物種中都被高度保留下來。相反地，較不重要的胺基酸則會隨 物種的需要而產生變異或者根本被剃除掉，所以這些差異可以幫助我們 了解酵素的環化機制。為了探求進一步的資訊，我們利用相似功能的同 一家族酵素其胺基酸序列比對，進而得知彼此間的相同性、相似性及性 質相近之胺基酸在比對序列時其排列之相對應位置，因而可以用來探討 酵素在結構上與功能上的相關性。而《圖1-28》則列出環化酵素家族的 蛋白質序列比對，其中包含：P.sativum的BAS、O.Europa的LUP、阿拉 伯芥（A. Thaliana）之CAS、阿拉伯芥（A.Thaliana）LAS、人類（H.sapiens） 之OSC以及酵母菌（S.cerevisiae）之OSC《圖1-28》。 Ps_BAS MWRLKIAEGGNDPYLFSTNNFVGRQTWEYDPEAGSEEERAQVEEARRNFYNNRFEVKPCG 60 Oe_LUP MWKLKIADG-TGPWLTTTNNHIGRQHWEFDPEAGTPDERVEVERLREEFKKNRFRTKQSA 59 At_CAS MWKLKIAEG-GSPWLRTTNNHVGRQFWEFDPNLGTPEDLAAVEEARKSFPDNRFVQKHSA 59 At_LAS MWRLKLSEG-DE---ESVNQHVGRQFWEYDNQFGTSEERHHINHLRSNFTLNRFSSKHSS 56 Hs_OSC ---MTEG---TCLRRRGGPYKTEPATDLGRWRLNCERGRQTWTYLQDERAG 45 Sc_OSC ---MTEF---YSDTIG---LPKTDPRLWRLRTDELGRESWEYLTPQQAAN 41 ::: : : . : : . Ps_BAS DLLWRFQVLREN-NFKQTIGGVKIEDEEE--ITYEKTTTTLRRGTHHLATLQTSD-GHWP 116 Oe_LUP DLLMRMQLVKEN-QRVQIPPAIKIKETEG--ITEEAVITTLRRAISFYSTIQAHD-GHWP 115 At_CAS DLLMRLQFSREN-LISPVLPQVKIEDTDD--VTEEMVETTLKRGLDFYSTIQAHD-GHWP 115 At_LAS DLLYRFQCWKEKGKGMERLPQVKVKEGEERLINEEVVNVTLRRSLRFYSILQSQD-GFWP 115 Hs_OSC REQTGLEAYALG---LDTKNYFKDLPK---AHTAFEGALN-GMTFYVGLQAED-GHWT 95 Sc_OSC DPPSTFTQWLLQ---DPKFPQPHPERNKHS--PDFSAFDACHNGASFFKLLQEPDSGIFP 96 : : : . . . :* * * :. 50
Ps_BAS AQIAGPLFFMPPLVFCVYITGHLDSVFPPEHRKEILRYIYCHQN-EDGGWGLHIEGHSTM 175 Oe_LUP AESAGPLFFLPPLVLALYVTGAINVVLSREHQKEITRYIYNHQN-EDGGWGIHIEGHSTM 174 At_CAS GDYGGPMFLLPGLIITLSITGALNTVLSEQHKQEMRRYLYNHQN-EDGGWGLHIEGPSTM 174 At_LAS GDYGGPLFLLPALVIGLYVTEVLDGTLTAQHQIEIRRYLYNHQN-KDGGWGLHVEGNSTM 174 Hs_OSC GDYGGPLFLLPGLLITCHVARIP---LPAGYREEIVRYLRSVQL-PDGGWGLHIEDKSTV 151 Sc_OSC CQYKGPMFMTIGYVAVNYIAGIE---IPEHERIELIRYIVNTAHPVDGGWGLHSVDKSTV 153 : **:*: : :: :. : *: **: *****:* . **: Ps_BAS FCTALNYICMRILGEGPDGGEDNACVRARNWIRQHGGVTHIPSWGKTWLSILGVFDWLGS 235 Oe_LUP FGSVLSYITLRLLGEGQEDGEDKAVARGRKWILDHGGAVGIPSWGKFWLTVLGVYEWDGC 234 At_CAS FGSVLNYVTLRLLGEGPNDG-DGDMEKGRDWILKYGGATNITSWGKMWLSVLGAFEWSGN 233 At_LAS FCTVLSYVALRLMGEELDGG-DGAMESARSWIHHHGGATFIPSWGKFWLSVLGAYEWSGN 233 Hs_OSC FGTALNYVSLRILGVGPDDP---DLVRARNILHKKGGAVAIPSWGKFWLAVLNVYSWEGL 208 Sc_OSC FGTVLNYVILRLLGLPKDHP---VCAKARSTLLRLGGAIGSPHWGKIWLSALNLYKWEGV 210 * :.*.*: :*::* : .*. : **. . *** **: *. :.* * Ps_BAS NPMPPEFWILPSFLPMHPAKMWCYCRLVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQLREELHTEPY 295 Oe_LUP NPMPPEFWLLPNFSPIHPGKMLCYCRLVYMPMSYLYGKRFVGPITGLVLSLRQEIYTEPY 294 At_CAS NPLPPEIWLLPYFLPIHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGKRFVGPITSTVLSLRKELFTVPY 293 At_LAS NPLPPELWLLPYSLPFHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGRRFVCRTNGTILSLRRELYTIPY 293 Hs_OSC NTLFPEMWLFPDWAPAHPSTLWCHCRQVYLPMSYCYAVRLSAAEDPLVQSLRQELYVEDF 268 Sc_OSC NPAPPETWLLPYSLPMHPGRWWVHTRGVYIPVSYLSLVKFSCPMTPLLEELRNEIYTKPF 270 *. ** *::* * **. : * **:*:** :: : .**.*:.. : Ps_BAS EKINWTKTRHLCAKEDIYYPHPLIQDLIWDSLYIFTEPLLTRWPFNKLVRKRALEVTMKH 355 Oe_LUP HGINWNRARNTCAKEDLYYPHPLAQDMLWGFLHHFAEPVLTRWPFSKLR-EKALKVAMEH 353 At_CAS HEVNWNEARNLCAKEDLYYPHPLVQDILWASLHKIVEPVLMRWPGANLR-EKAIRTAIEH 352 At_LAS HHIDWDTARNQCAKEDLYYPHPKIQDVLWSCLNKFGEPLLERWPLNNLR-NHALQTVMQH 352 Hs_OSC ASIDWLAQRNNVAPDELYTPHSWLLRVVYALLN---LYEHHHSAHLR-QRAVQKLYEH 322 Sc_OSC DKINFSKNRNTVCGVDLYYPHSTTLNIANSLVVFYEKYLRNRFIYSLSK---KKVYDL 325 ::: *: . ::* **. : : : : . . 51
Ps_BAS IHYEDENSRYLTIGCVEKVLCMLACWVED-PNGDAFKKHIARVPDYLWISEDGMTMQSF- 413 Oe_LUP VHYEDMNSRYLCIGCVEKVLCLIACWVED-PNSEAYKRHIARIPDYFWVAEDGLKMQSF- 411 At_CAS IHYEDENTRYICIGPVNKVLNMLCCWVED-PNSEAFKLHLPRIHDFLWLAEDGMKMQGYN 411 At_LAS IHYEDQNSHYICIGPVNKVLNMLCCWVES-SNSEAFKSHLSRIKDYLWVAEDGMKMQGYN 411 Hs_OSC IVADDRFTKSISIGPISKTINMLVRWYVDGPASTAFQEHVSRIPDYLWMGLDGMKMQGTN 382 Sc_OSC IKTELQNTDSLCIAPVNQAFCALVTLIEEGVDSEAFQRLQYRFKDALFHGPQGMTIMGTN 385 : : : : *. :.:.: : . . *:: *. * :: . :*:.: . Ps_BAS GSQEWDAGFAVQALLATN--LIEEIKPALAKGHDFIKKSQVTENPSGDFKSMHRHISKGS 471 Oe_LUP GCQMWDAAFAIQAILSSN--LAEEYGPTLMKAHNFVKASQVQENPSGDFNEMYRHTSKGA 469 At_CAS GSQLWDTGFAIQAILATN--LVEEYGPVLEKAHSFVKNSQVLEDCPGDLNYWYRHISKGA 469 At_LAS GSQLWDVTLAVQAILATN--LVDDYGLMLKKAHNYIKNTQIRKDTSGDPGLWYRHPCKGG 469 Hs_OSC GSQIWDTAFAIQALLEAGGHHRPEFSSCLQKAHEFLRLSQVPDNPP-DYQKYYRQMRKGG 441 Sc_OSC GVQTWDCAFAIQYFFVAGLAERPEFYNTIVSAYKFLCHAQFD---TECVPGSYRDKRKGA 442 * * ** :*:* :: :. : : ..:.:: :*. . :*. **. Ps_BAS WTFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCCLLLSLLPP-EIVGEKMEPERLFDSVNLLLSLQSKK-- 528 Oe_LUP WTFSMQDHGWQVSDCTAEGLKAALLFSQMPI-ELVGAEIETGHLYDAVNVILTLQSAS-- 526 At_CAS WPFSTADHGWPISDCTAEGLKAALLLSKVPK-EIVGEPIDAKRLYEAVNVIISLQNAD-- 526 At_LAS WGFSTGDNPWPVSDCTAEALKAALLLSQMPV-NLVGEPMPEEHLVDAVNFILSLQNKN-- 526 Hs_OSC FSFSTLDCGWIVSDCTAEALKAVLLLQEKCP-HVT-EHIPRERLCDAVAVLLNMRNPD-- 497 Sc_OSC WGFSTKTQGYTVADCTAEAIKAIIMVKNSPVFSEVHHMISSERLFEGIDVLLNLQNIGSF 502 : ** : ::*****.:*. ::.. . : :* :.: .::.::. Ps_BAS --GGLAAWEPAGAQEWLELLNPTEFFADIVVEHEYVECTGSAIQALVLFKKLYPGHRKKE 586 Oe_LUP --GGFPAWEPQKAYRWLEKLNPTEFFEDVLIERDYVECTSSAVQALKLFKQLHPGHRRKE 584 At_CAS --GGLATYELTRSYPWLELINPAETFGDIVIDYPYVECTSAAIQALISFRKLYPGHRKKE 584 At_LAS --GGFASYELTRSYPELEVINPSETFGDIIIDYQYVECTSAAIQGLVLFTTLNSSYKRKE 584 Hs_OSC --GGFATYETKRGGHLLELLNPSEVFGDIMIDYTYVECTSAVMQALKYFHKRFPEHRAAE 555 Sc_OSC EYGSFATYEKIKAPLAMETLNPAEVFGNIMVEYPYVECTDSSVLGLTYFHKYFD-YRKEE 561 *.:.::* . :* :**:* * ::::: *****.: : .* * :: * 52
