登革病毒的歷史與現況 - 以四環素及其衍生物為第二型登革熱病毒之抑制劑

在近代西元歷史上，早在西元1779 年到 1780 年，登革病毒就已在印尼雅加達、埃及開羅以及北美的費城爆發流行 (Ligon, 2005)。1950 年代，登革熱病毒只在九個國家現蹤，到了今日，登革病毒已分布超過一百個國家 (Guha-Sapir and Schimmer, 2005)。根據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）的統計數據顯示，每年感染登革病毒的人口數都在增加，據估計有超過二十五億的人口是生活在遭受登革病毒感染的威脅下，雖然其中大部分的感染者無明顯症狀產生，但仍有為數不少的感染者會出現 dengue fever (DF)症狀或是更嚴重的 dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS) 症狀，其中 DHF/DSS 的致死率達 5 ％ (Guha-Sapir and Schimmer, 2005)。在台灣，曾在 1 9 1 5、 1 9 3 1、 1 9 4 2 年發生三次全島性登革熱大流行以及 1 9 8 1 年屏東縣琉球鄉爆發第二型登革病毒疫情 ( Wu , 1 9 8 6 )。根據行政院衛生署疾病管制局的統計顯示，近年來每年或多或少都有登革

熱的確定病例 ( 如圖一 ) ，除了陸陸續續出現的境外移入病例，本土型登革病毒感染的病例也有週期性增加的趨勢 ( 行政院衛生署疾病管制局, 2 0 0 7 ) 。

1.3 登革病症的臨床病徵

臨床上，登革病毒（dengue virus, DV）依其血清抗原的不同可分為四個血清型（serotype），分別是DV-1、DV-2、DV-3及DV-4，根據台灣地區的登革疫情統計，四型的病毒感染皆發生。根據目前的看法，當DV隨蚊子唾液進入人體內並於血管內皮細胞中短暫增殖後（潛伏期 3 到 14 天，平均 4 到 7 天 (Kao et al., 2005)），DV再釋放到血流中造成病毒血症（viremia）並破壞組織，病患開始有臨床症狀出現。臨床症狀可能為無症狀（asymptomatic），或依其嚴重程度可區分為三種：登革熱（dengue fever, DF）、登革出血熱（dengue hemorrhagic fever, DHF）以及登革休克症候群（dengue shock syndrome, DSS）。

感染登革病毒的病患初期只會引起輕微的 DF 病症，類似感冒的症狀，如：

發燒、頭痛、眼窩疼痛、肌肉關節痠痛、皮膚紅疹、淋巴結腫大及白血球減少的病徵 (Nimmannitya, 1987)，在臨床實驗室的診斷上，亦發現患有DF的病患有嗜中性白血球較低（neutropenia）與血小板較少（thrombocytopenia）的現象。多數病人的初次感染都可自然的痊癒，但有些報導指出，在某些情況下，如遭受 DV 的二次感染（secondary infection）且是不同血清型的交叉感染將造成嚴重的 DHF/DSS (Gubler, 1998; Guzman et al., 2000)，此一派理論認為這是因為發生 antibody-dependent enhancement (ADE)現象所造成的。DHF 的病徵初期與 DF 相同，即病患持續二至七天發高燒，但在退燒後，DHF 病患由於血管內皮細胞受到影響，造成血管通透性（capillary permeability）增加，因此有血漿漏出（plasma leakage ）的現象發生，血漿蛋白流至血管外造成水腫，紅血球濃縮

（hemoconcentration），胸腔液滲出（pleural effusion）及產生腹水等現象，同時伴隨有 thrombocytopenia，所以 DHF 病患會在體表或內臟呈現出血現象。DSS

的病徵與 DHF 相同，並伴隨血壓下降而發生休克的現象 (Kalayanarooj et al., 1997)。

在某些病例中可以觀察到初次感染 DV 的情況下，患者亦會有 DHF/DSS 的病症發生，而前述因二次感染造成 DHF/DSS 的致病機轉之說法無法解釋此現象，於是有另一說法認為病患因其所感染的病毒株毒性不同，導致病症的嚴重程度不一，當感染到毒性較劇的病毒時就易造成嚴重的 DHF/DSS 症狀 (Vaughn et al., 1997; Vaughn et al., 2000; Libraty et al., 2002)。還有第三種說法指出 DV 會感染人類的內皮細胞（endothelial cells）且會誘發 IL-6 與 IL-8 的產生而導致出現 DHF/DSS 病徵 (Huang et al., 2000)。上述這三種理論可能說明了造成 DHF/DSS 的致病機轉是多因性的（multi-factorial），但其詳細的致病機制至今仍未完全明瞭 (Guha-Sapir and Schimmer, 2005)。

1.4 登革病毒之分子生物學背景

登革病毒（DV）是一具有正向單股 RNA 的具膜病毒（enveloped virus），

在分類學上屬於黃質病毒科（Flaviviridae）的黃質病毒屬（Flavivirus）。完整的 病毒直徑大小為50 nm (Henchal and Putnak, 1990)。DV 的基因體（genome）全長 11 kb，在 5’端有 cap 結構，而 3’端則是缺乏 Poly A 序列。而據研究指出 3’

端的UTR 會形成 stem-loop (3’SL)對於整個病毒 RNA 的複製扮演著必要的角色 (Harris et al., 2006)。登革病毒具有單一個 open reading frame，一般認為它會在粗內質網（rough endoplasmic reticulum）先轉譯（translation）出一個聚蛋白質

（polyprotein），再經由病毒本身的蛋白質酵素（viral protease）及宿主細胞的訊息酵素（signalase）作用，由聚蛋白質產生（process）出三個結構性蛋白（structural protein）來構成病毒結構的部份：衣殼蛋白（capsid protein, C）、前驅膜蛋白

（precursor membrane protein, prM）及外膜蛋白（envelope protein, E），和七個非結構性蛋白（non-structural protein）包括 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、

NS4B 及 NS5 (Henchal and Putnak, 1990)。

衣殼蛋白（C）會包住病毒的核酸形成核衣殼核心（nucleocapsid core）；前驅膜蛋白（prM）會幫助外膜蛋白（E）摺疊與組裝，前驅膜蛋白經切割後會形成 pr peptide 和膜蛋白（M），膜蛋白和外膜蛋白同為鑲嵌在病毒外套上的蛋白質 (Mukhopadhyay et al., 2005)。非結構性蛋白 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、

NS4B 及 NS5，一般認為是參與病毒複製、轉錄及轉譯病毒蛋白過程中的功能蛋白 (You et al.,1999)。

對病毒複製的過程，目前最普遍的看法是：當病毒顆粒（virion）的外膜蛋白與宿主細胞的受體（receptor）結合後，經由內胞飲作用（endocytosis）進入宿主細胞。病毒顆粒被包在內體小泡（endosomal vesicle）的酸性環境中，使得病毒顆粒的構形發生改變，病毒和細胞的細胞膜融合（fusion）在一起，將病毒的 nucleocapsid 釋放到細胞質中，之後經由去外套蛋白（uncoating）的程序使病毒的基因體（genome）釋出於細胞質中，基因體進行轉錄、轉譯的工作，新合成的RNA 及結構性蛋白進入到內質網的內腔中，接著 RNA 及結構性蛋白在內質網的表面組合成未成熟且不具感染力的病毒顆粒，細胞再將之運送到反式高爾基氏網（trans-Golgi network），經由宿主細胞蛋白酶修飾後，此時病毒顆粒已成熟並具感染力，此成熟的病毒顆粒隨即經由細胞的胞泌作用（exocytosis）釋放到細胞外 (Mukhopadhyay et al., 2005)。

1.5 登革病毒外膜蛋白性質

E protein 有 495 個胺基酸，分子量約 60 kDa。它是一醣蛋白（glycoprotein），為成熟登革病毒顆粒表面上最主要的結構性蛋白，位於病毒脂質雙層膜的外側，

是一個穿膜蛋白質，在與細胞受體結合及與宿主細胞膜融合皆扮演重要角色 (Allison et al., 2001)。同時，它也是引起寄主保護免疫的一級抗原且為病毒中和試驗中的主要抗原，故 E protein 直接地影響著登革病毒的感染宿主範圍與細胞感染趨性（cellular tropism） (Heinz, 1986; Chiu and Yang, 2003)。

近年來，已有學者以 X-ray 繞射的方法解出登革病毒二型（DV-2）及同為黃質病毒屬的TBEV（tick-borne encephalitis virus）的 E protein 之結晶結構，此解出的 E protein 結構只包含位在脂質膜外的蛋白質部分（ectodomain : residues 1-395） (Rey et al., 1995; Modis et al., 2003; Zhang et al., 2004)。根據此結構，E protein 是以頭對尾（head-to-tail）的方式兩兩成對成為雙體（dimer）模式，以一個單體（monomer）的 E protein 而言，其膜外部分可分為三個區域（domain）：

domain I、domainⅡ及 domainⅢ。Domain I 包含了第 1-51、132-192 及 280-295 的胺基酸，是E proein 的中央區域；domainⅡ包含了第 52-131 和 193-279 的胺基酸，負責和另外一個E protein 形成雙體，domainⅡ的末端含有一個 fusion peptide

（第98-110 的胺基酸） (Allison et al., 2001)，負責媒介病毒及寄主之 lipid bilayer 之融合；而domain I 的另一端則與 domainⅢ接合，domainⅢ包含第 296-394 的胺基酸，是一個immunoglobulin（Ig）-like domain，被認為是與宿主細胞之受體結合的位置，單株抗體可辨識domainⅢ以中和病毒，阻礙病毒入侵宿主細胞 (如圖二所示) (Thullier et al., 1999; Crill and Roehrig, 2001；Modis et al.,2004；Chiu and Yang, 2003; Mukhopadhyay et al., 2005)。

在中性酸鹼值的環境下，E protein 形成雙體結構，而當病毒顆粒進入宿主細胞後，一開始病毒顆粒會被包在內體小泡（endosomal vesicle）的酸性環境中，

在酸性環境的催化下，E protein 的雙體結構（dimer）會分離成單體（monomer）

後，再聚集成三體結構（trimer） (Allison et al., 1995; Stiasny et al., 1996; Stiasny et al., 2001)。E protein 的 domainⅡ因為蛋白質構型的改變，突出於 E protein 雙體原本構成的平面之上，促使病毒的外套膜和細胞內膜進行膜融合。

1.6 四環素家族的性質

四環黴素（簡稱四環素）是一種抗生素，藉由進入細菌體內，與 30S 核醣體上的 A-site 結合，以阻斷aminoacyl-tRNA 與 30S 核醣體結合，使新的胺基酸單體無法加到胜肽鏈上，阻斷細菌的蛋白質合成，達到抗菌效果 (Anokhina et al.,

2004)。主要用於治療細菌感染（如黴漿菌、披衣菌……等等）及幫助控制青春痘；口服四環素可能發生之副作用包括噁心、腹瀉、對陽光產生敏感，使成長孩童牙齒變黃及延緩骨骼生長，本實驗所使用之藥物及其結構如圖三，這是因四環黴素會吸收人體內的鈣離子與鐵離子的緣故 (Riaz et al., 1984)。

1.7 核糖酶的性質

大多數核酶通過催化轉磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應參與 RNA 自身剪切、加工過程。

有催化能力的核糖核酸（RNA），一般叫核糖酶。是 1981 年切赫（T·R·Cech）

最先發現的，之後由他命名，並於 1989 年獲得諾貝爾化學獎。和蛋白質的酶（蛋白質）相比，細胞內的RNA酶是極少的。現在已知的幾十種天然RNA酶的絕大部分參與RNA的加工和成熟。按它們的作用方式可分為剪切型（把RNA前體的多餘部分切除），和剪接型（把RNA前體的內含子部分切除並把不連續的外顯子部分連接起來） (Johnston et al., 2001)。根據所作用的底物不同，又可分成自體催化和異體催化兩類。絕大多數RNA酶以自身為基本進行自體催化，可以是自我剪切，也可以是自我剪接。

2.材料與方法

2.1.材料

2.1.1 菌株

Escherichia coli DH5α （Dr. Yang’s laboratory collection）

2.1.2 細胞株

BHK-21（幼倉鼠腎臟纖維母細胞，baby hamster kidney cell）

C6/36（白線斑蚊細胞，Aedes albopictus larva cell）

2.1.3 病毒

PL046 strain（Dengue virus type 2 Taiwan local strain）

2.1.4 質體

質體名稱特性 Reference

pcDNA3-NCS/5’Z (IRES)NS3’UTR

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 pBAG 且含有 Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶有 PL046 strain 的 5’UTR，下游帶有 IRES、PL046 strain 的非結構性基因及3’UTR。lac Z 與非結構性基因分別使用各自的 ORF。

賴建斈 2006/

楊昀良實驗室

pGEM-T-Ribo pGEM-T cloning HCV ribozyme 在 Apa I~Apa I sites 本研究

2.1.5 引子

引子序列5’~3’ 位置

Ribor {GGGGCCCAAGGTGAGATGA AGCTGTA} DV-2 (NGC；M29095) gene︰+10542~+10567 Ribo1 GACGGATCTAGATCCGTC{AGAACCTGTTGA

}

DV-2 (NGC；M29095) gene︰+10712~+10723 Ribo2 CCTCACGGACTCATCAGGACGGATCTAG

Ribo3 AGGGCCCCAGGTTCTTCGTCCTCACGGACT ({}為 gene 敘述之位置；_為限制酶切位) 2.1.6 藥品試劑

2.1.6.1 藥品

藥品名稱製造公司目錄編號應用

1kb DNA ladder SibEnzyme SEM11C001 DNA 電泳

Agarose VEGONIA 9201-05 核酸電泳

Ampicillin Applichem A0839 細菌培養

Chlortetracycline Sigma C-4881 溶斑試驗 Crystal Violet Sigma C-3886 Staining Demeclocycline Sigma D-6140 溶斑試驗

DMSO Sigma D-8418 冷凍細胞

Doxycycline Sigma D-9891 溶斑試驗

EDTA AMRESCO 0105 緩衝液

EtBr Sigma E-7637 Staining

Ex Tag polymerase TaKaRa RR001B 質體構築

Fetal Bovine Serum Biological industries

04-001-1A 細胞培養

Formaldehyde Riedel-de Haën 33220 固定細胞

Kanamycin Sigma K4000 細菌培養

在文檔中以四環素及其衍生物為第二型登革熱病毒之抑制劑 (頁 8-0)