萃取洋菜膠內之 DNA 片段 - 方法 - 以四環素及其衍生物為第二型登革熱病毒之抑制劑

2.2 方法

2.2.8 萃取洋菜膠內之 DNA 片段

使用Gel Extraction Kit (PREMIER, N-DCE050)萃取出洋菜膠內之DNA片段。操作流程如下：將切下之洋菜膠 (約 50-200 mg)，置於微量離心管內，加入 500 μl Binding Solution，60℃加熱至完全溶解後，將混合液移至Gel-M^TM

Column，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，加入 700 μl Washing

Buffer，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，再加入 700 μl Washing Buffer，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘，倒掉收集管內液體，再以室溫 13000 rpm 離心3 分鐘，將Gel-M^TMColumn移至新微量離心管，於 55~60℃的烘箱中 5 分鐘把多餘的酒精去除，再加入30 μl二次無菌水於Gel-M^TMColumn中，以室溫 13000 rpm離心 1 分鐘後，將萃取出之DNA儲存於-20℃。

3.結果 3.1 以溶斑試驗進行藥物測試

利用所得到的藥品清單將其編號為T1 (tetracycline)、T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)、T4 (demeclocycline)、T5 (oxytetracycline)、T6 (chlortetracycline)、

T7 (minocycline)進行測試 (之後均以 T1、T2、T3…T7 等稱呼)，在 BHK21 細胞株中進行藥物影響登革熱病毒感染過程的實驗，利用溶斑試驗 (plaque assay)這個方法來測試藥物，於測試後計算其溶斑 (plaque)數，而在設計實驗中均以兩個控制作為控制組，其中control-1 為未加入病毒與藥物，而 control-2 為加入病毒但並不加入藥物。

在 T1 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、100 μM 及 1000 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，分別是10 μM 有 198、223、134 個溶斑數，在 100 μM 有 205、

181、124 個溶斑數，在 1000 μM 有 207、192、126 個溶斑數，而控制組的 control-1 溶斑數三次重複均為0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的 positive 溶斑數191、185、126 個進行計算，以 control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的 PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在 10 μM 時為 110.18%，100 μM 時為101.19%，1000 μM 時為 104.05%，其標準差在 10 μM 時為 9.07%，100 μM 時為5.32%，1000 μM 時為 4.19%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖四 A、B)。

在 T2 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、100 μM、300 μM 及 500 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，分別是10 μM 有 180、172、113 個溶斑數，100 μM 有 38、29、10 個溶斑數，300 μM 有 26、27、7 個溶斑數，500 μM 有 2、2、1 個溶斑數，而控制組的control-1 溶斑數三次重複均為 0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的control-2 溶斑數 191、196、143 個進行計算，以 control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計

算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 87.01%，100 μM 時為 13.89%，300 μM 時為 10.76%，500 μM 時為0.92%，其標準差在 10 μM 時為 7.64%，100 μM 時為 6.50%，300 μM 時為 5.08%，500 μM 時為 0.19%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖五A、B)。由折線圖求得 IC50 約為 54.45 μM。

在 T3 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、100 μM、300 μM 及 500 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，分別是10 μM 有 195、192、130 個溶斑數，100 μM 有 30、44、35 個溶斑數，300 μM 有 9、12、6 個溶斑數，500 μM 有 5、3、4 個溶斑數，而控制組的control-1 溶斑數三次重複均為 0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的control-2 溶斑數 186、189、141 個進行計算，以 control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 99.54%，100 μM 時為 21.41%，300 μM 時為 5.15%，500 μM 時為 2.37%，其標準差在 10 μM 時為 6.56%，100 μM 時為 4.64%，300 μM 時為 1.08%，

500 μM 時為 0.68%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖六 A、

B)。由折線圖求得 IC50 約為 67.07 μM。

在 T4 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、50 μM 、100 μM、200 μM、300 μM、

400 μM、500 μM、600 μM、700 μM 及 800 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，

分別是10 μM 有 189、148、159 個溶斑數，50 μM 有 192、152、161 個溶斑數，

100 μM 有 197、151、158 個溶斑數，200 μM 有 199、150、153 個溶斑數，300 μM 有114、82、87 個溶斑數，而在 300 μM 之後的 400 μM~800 μM 在顯微鏡下觀察發現其細胞為懸浮狀態並不是如同一般溶斑試驗中細胞貼附培養皿的現象，在固

定細胞後染色過後也發現到染不上顏色，無法觀察到溶斑的出現，故採計10

μM~300 μM 的部份。其控制組的 control-1 溶斑數三次重複均為 0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的control-2 溶斑數 196、154、161 個進行計算，

以control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以

百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 97.10%，50 μM 時為 98.89%，100 μM 時為 98.90%，

200 μM 時為 97.99%，300 μM 時為 55.15%，其標準差在 10 μM 時為 1.45%，50 μM 時為1.03%，100 μM 時為 1.40%，200 μM 時為 3.29%，300 μM 時為 2.64%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖七 A、B)。

在 T5 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、50 μM 、100 μM、200 μM、300 μM、

400 μM、500 μM、600 μM、700 μM 及 800 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，

分別是10 μM 有 63、132、135 個溶斑數，50 μM 有 69、145、156 個溶斑數，100 μM 有 69、144、155 個溶斑數，200 μM 有 65、134、143 個溶斑數，300 μM 有 57、125、131 個溶斑數，400 μM 有 54、115、126 個溶斑數，500 μM 有 49、104、

114 個溶斑數，600 μM 有 42、92、106 個溶斑數，700 μM 有 37、83、96 個溶斑數，800 μM 有 32、72、80 個溶斑數。其控制組的 control-1 溶斑數三次重複均為 0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的 control-2 溶斑數 69、145、158 個進行計算，以control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，

相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 89.26%，50 μM 時為 99.58%，100 μM 時為99.14%，200 μM 時為 92.37%，300 μM 時為 83.91%，400 μM 時為 79.11%，

500 μM 時為 71.63%，600 μM 時為 63.80%，700 μM 時為 57.21%，800 μM 時為 48.89%，其標準差在 10 μM 時為 3.31%，50 μM 時為 0.73%，100 μM 時為 0.96%，

200 μM 時為 1.85%，300 μM 時為 2.00%，400 μM 時為 0.76%，500 μM 時為 0.57%，

600 μM 時為 3.12%，700 μM 時為 3.57%，800 μM 時為 2.23%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖八 A、B)。而由於 800 μM 時溶斑試驗結果為 48.89%，所以進一步測試更高的濃度，因 800 μM 約為 50%左右，100 μM 時約為90%左右，考慮曲線的趨勢及對稱性，故取藥物濃度 800 μM、900 μM、1000 μM、1100 μM、1200 μM、1300 μM、1400 μM、1500 μM、2000 μM、2500 μM 及3000 μM。在每個濃度點的溶斑計數上，分別是 800 μM 有 88、85、90 個溶斑

數，900 μM 有 75、74、72 個溶斑數，1000 μM 有 69、69、67 個溶斑數，1100 μM 有64、67、63 個溶斑數，1200 μM 有 58、60、57 個溶斑數，1300 μM 有 55、56、

55 個溶斑數，1400 μM 有 50、51、53 個溶斑數，1500 μM 有 31、32、29 個溶斑數，而2000 μM 以上在顯微鏡下觀察發現其細胞為懸浮狀態並不是如同一般溶斑試驗中細胞貼附培養皿的現象，在固定細胞後染色過後也發現到染不上顏色，

無法觀察到溶斑的出現，故採計800 μM~1500 μM 的部份。其控制組的 control-1 溶斑數為0 個，分別將每個濃度的溶斑數與控制組的 control-2 溶斑數 182 個進行計算，以control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在800 μM 時為 48.17%，900 μM 時為 40.48%，1000 μM 時為37.55%，1100 μM 時為 35.53%，1200 μM 時為 32.05%，1300 μM 時為 30.40%，1400 μM 時為 28.21%，1500 μM 時為 16.85%，其標準差在 800 μM 時為1.38%，900 μM 時為 0.84%，1000 μM 時為 0.63%，1100 μM 時為 1.14%，1200 μM 時為 0.84%，1300 μM 時為 0.32%，1400 μM 時為 0.84%，1500 μM 時為 0.84%。

而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖八 C、D)，綜合 10 μM~1500 μM 的數據製成折線圖 (圖八 E)。

在 T6 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、50 μM 、100 μM、200 μM、300 μM、

400 μM、500 μM、600 μM、700 μM 及 800 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，

分別是10 μM 有 151、153、150 個溶斑數，50 μM 有 132、137、135 個溶斑數，

100 μM 有 123、122、117 個溶斑數，200 μM 有 101、79、75 個溶斑數，300 μM 有69、66、60 個溶斑數，400 μM 有 46、32、30 個溶斑數，500 μM 有 27、28、

27 個溶斑數，600 μM 有 20、27、26 個溶斑數，700 μM 有 13、9、8 個溶斑數，

800 μM 有 9、9、7 個溶斑數。其控制組的 control-1 溶斑數三次重複均為 0 個，

分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的control-2 溶斑數 156、190、175 個進行計算，以control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實

驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 87.68%，50 μM 時為 77.95%，100 μM 時為69.97%，200 μM 時為 49.73%，300 μM 時為 37.75%，400 μM 時為 21.16%，

500 μM 時為 15.82%，600 μM 時為 13.96%，700 μM 時為 5.88%，800 μM 時為 4.84%，其標準差在 10 μM 時為 8.31%，50 μM 時為 6.29%，100 μM 時為 7.80%，

200 μM 時為 13.02%，300 μM 時為 5.62%，400 μM 時為 7.22%，500 μM 時為 1.33%，600 μM 時為 1.04%，700 μM 時為 2.13%，800 μM 時為 0.89%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖九 A、B)。由折線圖求得 IC50 約為 198.67 μM。

在 T7 的部份，藥物濃度取的是 10 μM、50 μM 、100 μM、200 μM、300 μM、

400 μM、500 μM、600 μM、700 μM 及 800 μM，在每個濃度點的溶斑計數上，

分別是10 μM 有 52、70、68 個溶斑數，50 μM 有 39、58、53 個溶斑數，100 μM 有75、60、52 個溶斑數，200 μM 有 71、63、51 個溶斑數，300 μM 有 74、64、

46 個溶斑數，而在 300 μM 之後的 400 μM~800 μM 在顯微鏡下觀察發現其細胞為懸浮狀態並不是如同一般溶斑試驗中細胞貼附培養皿的現象，在固定細胞後染

色過後也發現到染不上顏色，無法觀察到溶斑的出現，類似T4 在溶斑試驗中出

現的情形，故同樣僅採計10 μM~300 μM 的部份。其控制組的 control-1 溶斑數三次重複均為0 個，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的 control-2 溶斑數 92、

75、69 個進行計算，以 control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在10 μM 時為 82.80%，50 μM 時為 65.51%，

100 μM 時為 78.96%，200 μM 時為 78.36%，300 μM 時為 77.48%，其標準差在 10 μM 時為 22.91%，50 μM 時為 20.02%，100 μM 時為 3.21%，200 μM 時為 5.15%，

300 μM 時為 9.68%。而利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖十 A、

B)。

3.2 以溶斑試驗進行時間點測試

利用time point assay這個方式，來進一步確認前項實驗的結果，過程為在細胞加入病毒顆粒後的不同時間點如-1 (即加入病毒前一小時，亦即依照前面藥物測試實驗重複為本實驗的控制組之一)、0、2、4、6、8、10、12、16、20 小時後，

加入藥物，藥物濃度以由前面測試藥物實驗時可測得PFU10%的濃度來作測試，

在經每個時間點加藥後，放置在5% CO2 37˚C的恆溫培養箱中經一小時後，加入含有1.1% methyl cellulose的 5% FBS MEM medium，再放置回 5% CO2 37˚C的恆溫培養箱培養5~7 天後，固定細胞並計數plaque數。其中控制組的control-1 為未加藥物與病毒，而control-2 為加入病毒但無藥物。

在T1 的部份，因為在前面的實驗加入藥物未看到 PFU 的百分比下降，因此僅隨意取一個濃度300 μM 來進行測試，經過測試在-1 小時時間點溶斑數為 104、

88、114，0 小時時間點溶斑數為 105、90、112，2 小時時間點溶斑數為 106、91、

120，4 小時時間點溶斑數為 107、92、117，6 小時時間點溶斑數為 109、92、118，

8 小時時間點溶斑數為 104、87、120，10 小時時間點溶斑數為 103、88、114，

12 小時時間點溶斑數為 108、89、116，16 小時時間點溶斑數為 107、92、117，

20 小時時間點溶斑數為 106、90、120。其控制組的 control-1 部份重複三次其溶斑數均為0，分別將每個濃度的溶斑數與當次控制組的 control-2 溶斑數 105、89、

119 個進行計算，以 control-2 的 PFU 數目為分母，實驗組各濃度的 PFU 數目為分子，相除並乘以百分之百，計算出此藥物在不同濃度下的PFU (%)，又利用三次重複實驗結果計算出其平均值在-1 小時時間點為 97.91%，0 小時時間點為 98.41%，2 小時時間點為 101.35%，4 小時時間點為 101.20%，6 小時時間點為 102.11%，8 小時時間點為 99.21%，10 小時時間點為 97.59%，12 小時時間點為 100.11%，16 小時時間點為 101.20%，20 小時時間點為 100.97%，其標準差在-1 小時時間點為1.83%，0 小時時間點為 3.76%，2 小時時間點為 0.78%，4 小時時間點為2.60%，6 小時時間點為 2.57%，8 小時時間點為 1.55%，10 小時時間點為1.60%，12 小時時間點為 2.69%，16 小時時間點為 2.60%，20 小時時間點為

0.14%。利用上述結果製圖，製成數據列表與折線圖 (圖十二 A、B)。

在T2 的部份，由前面實驗的折線圖取得可得到 PFU 10%左右的藥物濃度 300 μM 來進行測試，而又因第一次實驗時，時間點到 4 小時之後 PFU (%)便持續 100%，因此後面兩次重複實驗均只重複-1、0、2、4 這幾個時間點。經過測試在

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