設計出ribo1、ribo2、ribo3 以及 ribor 等，四條引子，藉以在登革熱病毒的 cDNA clone (pcDNA3-NCS/5’ZNS3’UTR)上的 3’UTR 後方利用三次 PCR 方式 (圖十六、圖十七)，分別利用 ribor+ribo1 延長原本的 cDNA 片段，經洋菜膠電泳 後純化，利用洋菜膠電泳確認其大小 (圖十八)，再以此片段以 ribor+ribo2 延長，
經洋菜膠電泳後純化此片段，利用洋菜膠電泳確認其大小 (圖十九)，再利用此 片段以ribor+ribo3 將原本 cDNA 來加上 ribozyme 來得到具有 ribozyme 的 DNA 片段，利用洋菜膠電泳確認其大小 (圖二十)。將此片段利用 T/A cloning 方式接 到pGEM-T 的載體上命名為 pGEM-T-Ribo，如圖二十一所示。經酵素作用後，
初步判定得到10 個具有 ribozyme 與部份登革熱病毒尾端序列的 DNA 片段的載 體分別命名為pGEM-T-Ribo1、pGEM-T-Ribo2、pGEM-T-Ribo3、pGEM-T-Ribo4、
pGEM-T-Ribo5、pGEM-T-Ribo6、pGEM-T-Ribo7、pGEM-T-Ribo8、
pGEM-T-Ribo9、pGEM-T-Ribo10。經過酵素 ApaI 作用後，預期得到 0.05、0.2、
3.0 kb 大小的 DNA 片段 (圖二十二 A)；經 XbaI 作用後，預期得到 3.2 kb 大小的 DNA 片段 (圖二十三 A)，其中 1~8 符合預期 (如圖二十二 A、B、圖二十三 A、
B 所示)。而後挑選 1、2、4、5 利用 pGEM-T 上的 T7＆SP6 序列為引子，作 sequence 來確定PCR 後的 DNA 片段是否有突變，如圖二十四所示。得到 pGEM-T-Ribo5 上為完全無突變的片段，命名為pGEM-T-Ribo。
4.討論
本實驗室之前與生資所楊進木老師合作以virtual screening 方式針對登革熱 病毒 (DV)的外膜蛋白 (E peotein)的結構進行篩選藥物，而所篩選的藥物為有可 能進入病毒的外膜蛋白中，並阻止其外膜蛋白在感染寄主細胞的過程中所產生的 型態變化進而阻止病毒感染寄主細胞的過程。而本實驗室得到的藥物清單為利用 程式所預測的前200 個藥物。在此名單中有兩個四環素家族的成員 T1
(tetracycline)、T3 (rolitetracycline)存在，又因四環素的四環本身為一固定的平面 結構，其四環素家族本身均是修飾其支鏈來形成其他的衍生物，便使用在藥品清 單中的那兩個成員tetracycline、rolitetracycline，以及利用本實驗室尚有另一不同 於前兩者的四環素成員T2 (doxycycline)進行測試，此時發現原本清單中的 rolitetracycline 及本實驗室未在藥品清單中的四環素成員 doxycycline 均對 PFU 產 生抑制的效果，但tetracycline 未觀察到抑制的現象產生，據此進行初步的推論，
乃由於之前是以結構來進行篩選，用此對其位在清單中卻未發現抑制能力與位在 清單之外卻發現有抑制能力，可給予假設來說明如下︰因為四環素家族結構類 似，可能發生形狀可進入外膜蛋白結構中，但是並不足以阻止其感染過程中的型 態變化，而清單外藥物doxycycline 同為四環素家族，其 side chain 經過修飾，而 可阻止其感染過程中的型態變化。基於上述假設，因此著手尋找可取得的四環素 家族成員來進行後續的測試。本實驗中共對七個四環素家族產物來進行測試，其 名單如下︰T1 (tetracycline)、T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)、T4
(demeclocycline)、T5 (oxytetracycline)、T6 (chlortetracycline)、T7 (minocycline)。
其結構如圖三所示。根據實驗結果進行討論，如下︰
在T1 (tetracycline)的部份上，由圖四 A、B 中，可看出其 PFU 百分比持續 保持在100%左右的位置並沒有隨著藥物的加入或是提高至 1000 μM 而跟 positive 有所區別。
而在T2 (doxycycline)的部份，圖五 A、B 中，可以觀察到在 100 μM 的地方 的PFU 百分比只剩下 13%左右，至 500 μM 只剩 0.92%，可觀察到明顯 PFU 被 抑制的情形。
T3 (rolitetracycline)的部份上，由圖六 A、B 中，可以觀察到在 100 μM 的地 方的PFU 百分比只剩下 20%左右，到了 300 μM 的位置 PFU 百分比只剩下 5%，
可觀察出在加入藥物後PFU 明顯被抑制的情形。
而在T4 (demeclocycline)的部份，由圖七 A、B 中，在 200 μM 到 300 μM 部 份開始有PFU 百分比下降的情形發生，但值得注意的是在 400 μM 之後，在固定 及染色後，6-well plate 上觀察不到細胞被染色的情形發生，在顯微鏡下可觀察到 細胞懸浮的情形 (圖十一 B)，故推論此藥物 T4 在 400 μM 以上可能對細胞有傷 害的作用，導致細胞無法在plate 表面上貼附而懸浮，由於尋找過文獻僅有餵食 山羊後的八小時後的血中藥物濃度經換算後約為164 μM (Jha et al., 1989)而另一 篇文獻中最高濃度也僅使用到150 μM (Jiang et al., 2005)，故以過去文獻上無法 確認如此的濃度是否確實會對細胞造成傷害。
在T5 的部份，由圖八 A、B 中，所觀察到的現象可看到 PFU 的百分比隨著 藥物濃度提昇100 μM 到 200 μM 便開始有下降的趨勢，且持續的提昇濃度 700 μM 到 800 μM 亦可看到 PFU 百分比的下降，但是下降的百分比不多，在藥物加 到800 μM 之後也還有 50%的 PFU 百分比，於是再次進行實驗，由於 800 μM 大 約有50%的 PFU 百分比，以此曲線的趨勢跟對稱度來考量，測試 800 μM ~ 1500 μM，並另外測試 2000 μM、2500 μM 及 3000 μM 觀察其在高濃度藥物下是否會
有更佳的抑制能力以及細胞在高濃度藥物下的存活情形。在圖八C、D 中，可觀
察到藥物濃度的提昇800 μM 到 900 μM 均仍有 PFU 百分比下降的情形，這種情 形隨著濃度提昇持續到1400 μM 到 1500 μM 亦可觀察到這種現象，但是下降的
百分比不多，在最後的1500 μM 會有 17%左右的 PFU 百分比，至於 2000 μM 以 上，在顯微鏡觀察下發現細胞有著破裂懸浮的情形 (圖十一 E)，因此無法測得溶 斑，故推論其藥物濃度在2000 μM 以上時，可能對細胞造成傷害。另外在 1500 μM 這個濃度下以顯微鏡觀察細胞，可以發現細胞在這個濃度下會發現到對照 無加入任何藥物的細胞形狀 (圖十一 A)有著明顯的延長 (圖十一 D)，推論是此 濃度可能已對細胞造成某種影響使得型態產生變化，而在達到2000 μM 時，此 藥物濃度會使細胞破裂而懸浮。以這個藥物與T2、T3 相比之下，藥物的抑制 PFU 能力相較之下是較弱的。推論其藥物對PFU 抑制的能力不如 T2、T3 這兩個藥物 強的原因，依假設來推論，可能是對外膜蛋白的結合能力較弱，因此抑制能力較 弱
在T6 (chlortetracycline)部份，由圖九 A、B 中，觀察從 10 μM 到 50 μM 便 有PFU 百分比下降的情形，而其抑制能力隨著濃度的提高而提昇，到了 800 μM 時更可達到10%PFU 的抑制能力，與 T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)相比 較，同樣具有較強的抑制能力 (與 T5 相比)。
在T7 的部份，由圖十 A、B 中，觀察到對 PFU 一直都具有部份的抑制能力，
使得PFU 從 100 μM 到 300 μM 持續保持在 80%左右，但值得注意的為其抑制能 力並未隨著濃度增高而提昇，而與T4 相似的，在 400 μM 以上時，同樣發生細 胞不貼附在plate 上，以致染色後，無法觀察到 plaque 的情形。此處同樣推論此 藥物T7 在 400 μM 以上可能對細胞有傷害的作用，導致細胞無法在 plate 表面上 貼附而懸浮。
總結以上7 個藥物經整理後的結果，觀察得出 T2 (doxycycline)、T3
(rolitetracycline)、T6 (chlortetracycline)具有較為明顯的抑制 PFU 能力，而在這個 部份，基於原本的發現與假設，此藥物抑制的機制應為針對病毒外殼蛋白，但為
求驗證，做出以下推論︰由於對PFU 有抑制的效果，於是考慮病毒感染的過程，
將其可能抑制機制歸納為下述類型﹕1.進入細胞時被抑制 2.在細胞內複製被抑 制 3.藥物對細胞本身有抑制作用 。因上述結論，對第一項類型來說，也是原本 所預期的功能，也就是模擬的藥物結構會卡在病毒的外殼蛋白上，影響立體結構 之改變，進而無法進入細胞中造成感染。對第二項類型來說，必須藉由對於病毒
感染後，對細胞作病毒RNA 的測量來確定。而第三項類型來說，因為同是四環
素家族，其功能為與原核生物的 30S 核醣體上的 A-site 結合，以阻斷
aminoacyl-tRNA 與 30S 核醣體結合，使新的胺基酸單體無法加到胜肽鏈上，阻 斷細菌的蛋白質合成，達到抗菌效果 (Anokhina et al., 2004)。而本實驗所使用 的細胞株為真核細胞，再加上同樣而類似的功能卻對細胞本身感染病毒後有不同 的作用產生，所以在這個部份，經判斷應為較不可能的。
針對以上第一項與第二項結論，想出了一個可以分辨的方式，由於著重在於 進入細胞的前後以及在細胞內的複製。於是設計出time point assay 這個實驗，此 實驗主要目的是著重在每個不同時間點加入藥物，藉由在不同時期的藥物添加，
所得到plaque 結果，可與病毒的生活週期作對照，而由文獻中得知 West Nile (WN) 感染細胞後的2~10 小時為其 RNA 複製的時間 (Lo et al., 2003)，由於 DV2 與 WN 為同為黃質病毒屬，其生活週期應該類似，因此沿用 WN 的生活週期來做推 論，來得出藥物作用的可能機制。
由time point assay 這個實驗結果 (圖十三 A、B、圖十四 A、B)可以觀察到，
T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)作用的時間曲線在-1 及 0 這兩個時間點觀察 到其PFU 百分比低落至 1~5%左右的情形，抑制的情形很明顯。可以推論出這兩 種藥物的抑制表現應該是作用在病毒進入細胞這段時期。而T6 (chlortetracycline) 這個藥物的時間曲線 (圖十五 A、B)，可看到在 12 小時這個時間點前的 PFU 百
分比都有低落的情形，可推論其作用可能是影響到病毒在細胞內的RNA 複製，
之所以做此推論，因考慮到文獻中同屬的WN 也是在感染後的 2~10 小時內進行 RNA 複製的動作，故利用 DV2 與 WN 同屬而可能相近的生活週期來推論 T6 (chlortetracycline)可能為抑制病毒在細胞內的 RNA 複製。
而作為對照組的T1 (tetracycline)的時間曲線 (圖十二 A、B)，明顯地看出 沒有太大的變動，PFU 百分比維持在 100%左右。
由於T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)於第一次實驗時便觀察到在初期 的時間曲線才有明顯變化，在4 小時這個時間點後，曲線便上升到接近 100%的 地方，因此在重複第二次與第三次實驗時，便省略後面的時間點，而只重複前面 -1~4 小時的幾個時間點。
根據上述結論，若要進一步驗證推論是否正確，對於T2 (doxycycline)、T3 (rolitetracycline)來說必須要針對登革熱病毒的 cDNA clone 在 E protein 上對當初 預測的胺基酸位置作點突變來驗證推測；而對於chlortetracycline 來說，必須要 有病毒的cDNA clone 將其 transfection 到細胞裡面進行表現，然後加入藥物，觀 察其複製是不是有被抑制的現象產生。而以上所有的未來目的都必需要有登革熱 病毒的cDNA clone，而在本實驗室中有登革熱二型的 cDNA clone (賴建斈 ,2006,交大碩士論文)，但是仍有不完全的部份，因此為了之後的目的，必須要修 正之前的cDNA clone。之前cDNA clone的表現方面出現問題，無法表現出具有感 染力的病毒顆粒，其可能的原因有1.登革病毒產生的蛋白對大腸桿菌具有毒性，
且CMV啟動子在大腸桿菌中產生leaky，造成得到的質體都是經過突變不具感染
且CMV啟動子在大腸桿菌中產生leaky，造成得到的質體都是經過突變不具感染