2-1 毛細管電泳分析法的發展歷史
電泳 (electrophoresis) 是電解質中的帶電粒子在直流電埸的作用下，
以不同的速度，向相反電荷方向遷移的現象。利用這種方式，對化合物達 到分離分析的技術，稱為電泳分析法。
電泳技術發展至今已有百年歷史。最早發展是在1886年時，由Lodge 在含有膠質的電解液中，兩端施以電壓，觀察顏色變化產生；1899年Hardy 利用含有膠質粒子的U 型管，發現了電泳的現象，並於1905年利用有刻 度的U 型管，記錄了膠質粒子的移動[21]；1937年Tiselius 應用此方法分 離出馬的三種血清蛋白，將它們分別命名為α、β、γ球蛋白[22]，使 電泳技術獲得重大突破，電泳技術漸漸受到重視，成為簡便而有效率的 分離技術。直到1965年Konstantinov 首度嘗試利用毛細管進行電泳分析 [23]，1967年 Hjerten 以內徑3 mm的石英管，進行無機離子、核酸與蛋 白質的分離[24] ，以及1979年Virtanen 和Mikkers 利用內徑200~500 μm 的玻璃材質與聚四氟乙烯材質的毛細管進行電泳[25-26]，證實了利用內 徑較小的毛細管能有效控制焦耳熱的產生，其後Martin 和Everaerts 的研 究，進一步確立以毛細管進行電泳分析 ( Capillary Electrophoresis,CE ) 的理論基礎[27]。1981年Jorgenson 使用內徑75 μm 的石英材質毛細管，
施加30kV的高壓電成功分離胺基酸衍生物，並結合螢光偵測的方法，以 有效提高偵測靈敏度[28]。1984年日本教授Terabe 使用含有界面活性劑 的緩衝溶液，提出微胞電動層析法 (Micellar electrokinetic
chromatography, MEKC或MECC)，在緩衝溶液中添加界面活性劑，利用 中性分子與界面活性劑之間分配係數的不同，可以成功分離不帶電的中
性物質[29]；隨後於1985 年Hjerten 利用兩性電解質的混合液，在電埸中 會產生不同的pH梯度，可以將蛋白質分離，稱為毛細管等電聚焦法 ( Capillary isoelectric focusing, CIEF )[30]；1987年Cohen等人將傳統的凝 膠電泳法，將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯氨在毛細管內形成凝膠，直接應 用在蛋白質的分離與分子量的決定，發展成毛細管凝膠電泳法
( Capillary gel electrophoresis, CGE )[31]；同年Tusda結合液相層析與毛細 管電泳的優點，在毛細管中填充固定相， 利用分析物在填充物及緩衝溶 液間的作用力不同，發展出毛細管電層析法 ( Capillary
electrochromatography, CEC )[32]；此外還有利用兩種緩衝溶液造成分離 區帶等速移動[33-36]，可同時分離正離子和負離子的毛細管等速電泳法 ( Capillary isotachophoresis, CITP )，以及新興的微晶片毛細管電泳分析法 ( Microchip capillary electrophoresis ) [37-41]。由於電泳技術日趨成熟且應 用廣泛，使毛細管電泳躍昇成為目前分析技術的主流。
毛細管電泳分析法具有許多優點，包含樣品及溶劑使用量少，分離 時間短且效率佳，可搭配不同的電泳模式，使分離物種類多樣化，加上 自動化儀器的普及，使CE技術被廣泛應用在刑事鑑定、藥物分析、環境 檢測、食品品管、生化醫藥上，成為簡便且有效率的分析方法[42-51]。
2-2 毛細管電泳儀器及操作介紹
毛細管電泳層析儀器的組件，如圖2-1所示，包含毛細管( capillary )、
高壓電電源 ( HV )、緩衝溶液儲存槽 ( buffer solution )、樣品儲存槽 ( sample solution )、偵測器 ( detector )。實驗時，先在毛細管中注滿緩衝 溶液或背景溶液 ( background solution, BGS )，再將適量的分析物進樣至 毛細管內，然後把毛細管兩端一起放入緩衝溶液儲存槽中，利用白金電 極通以高壓直流電，即可進行電泳分析。
圖 2-1 毛細管電泳裝置簡圖
(1)虹吸進樣時，將毛細管兩端分別置於sample solution及2號 buffer solution 中，並將sample solution 抬高，利用兩端壓力 差將樣品注入毛細管內。
(2)進樣完成後，將毛細管兩端分別放入1號和2號buffer solution 中，通入高壓電，進行電泳分析。
2-3 微胞電動層析法 ( Micellar electrokinetic chromatography, MEKC )的分離模式
毛細管電泳層析法有多種分離模式，各種模式的分離機制不同，本 實驗主要採用微胞電動層析法( Micellar electrokinetic chromatography, MEKC )。
2-3.1 微胞電動層析法
微胞電動層析法由Terabe 在1984年提出，是一種既能分離中性分析 物同時又能分離帶電物質的電泳技術，在多種電泳模式中被應用的也最 為廣泛。微胞電動層析法是指在緩衝溶液中加入各種不同的界面活性 劑，界面活性劑的分子結構有親水性和疏水性兩個部分，當其濃度達到 臨界微胞濃度 ( critical micelles concentration, CMC )以上時，分子內疏水 性的一端會聚集在一起，向內排列，親水性的一端則會朝向緩衝溶液，
因而形成團狀的陽離子型和陰離子型的兩種微胞。
在緩衝溶液中，微胞的遷移方向，取決於微胞帶電的種類，對陰離 子型界面活性劑而言，例如常用的十二烷基硫酸鈉 ( sodium dodecyl sulfate, SDS )，其微胞的電泳遷移方向和EOF相反，因此與微胞作用力較 大的分析物，和微胞結合後，在電泳過程中滯留的時間較長，相對與微 胞結合力弱的分析物，滯留時間較短，利用遷移速率差異達到分離的效 果，如圖2-2所示。
選用不同的界面活性劑，就像在液相層析法中改變固定相一樣，表
對分析物的選擇性產生明顯改變，此外緩衝溶液濃度、pH、溫度、添加 修飾劑、手性選擇劑等因素，也會改變微胞與分析物的結合度，影響分 離結果。
---Sodium polyoxyethylene dodecyl ether sulfate
2.8 66
Sodium N-dodecanoyl-L-valinate
5.7 (40℃)
---Cationic
Tetradecyltrimethylammonium bromide (TTAB)3.5 75
Dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB)
15 56
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)
0.92 61
Cetyltrimethylammonium chloride
1.3
---Nonionic
Polyoxyethylene (23) dodecyl ether (Brij 35)0.1
---Polyoxyethylene (23) sorbitan monolaurate (Tween 20)0.059
---Zwitterionic
3-[(3-cholamiddopropyl)dimethylammonio]2-4 毛細管電泳線上濃縮技術
利用毛細管電泳分析法，進行樣品分析實驗，會有偵測極限不佳的 缺點，常用的毛細管電泳結合紫外光偵測法 ( CE/UV )，其偵測極限只有 大約10-5~10-6M，改善偵測極限常見的方法如下︰(一)將毛細管的光徑加 大[53]，例如使用直角毛細管、Z 形毛細管、或泡狀毛細管 ( bubble cell )，可增加光的吸收度；(二)利用多次反射槽 ( multi-reflection cell ) 來增加光徑的距離，提高偵測靈敏度[54]；(三)利用液相萃取或固相萃取 的樣品前處理步驟，提高樣品的濃度[55]；(四)選用偵測效果更好的偵測 器，例如使用雷射誘導螢光偵測器 ( Laser Induced Fluoresence,
LIF )[56]，其偵測極限可達到10-10M 以下，但本身具有螢光性質的分析 物並不多，所以分析物需經過衍生處理才能偵測，且雷射價格非常昂貴。
除了以上幾種改良方法之外，可在電泳過程中同時進行樣品堆積 ( sample stacking )，來降低偵測極限，此方法即有效又經濟。樣品堆積的 原理是先延長樣品的進樣時間，使總進樣量增加，此時樣品區帶亦隨之 變長，再透過樣品區帶的聚集濃縮，提高樣品的濃度。此方法不需預先 於實驗前進行樣品濃縮，而是在電泳過程中，同時達成樣品堆積與分離，
所以稱此技術為線上濃縮 ( on-line concentration )。
Mikkers 首先提出了毛細管電泳中樣品堆積的研究，但由於中性分 析物在電埸中沒有明顯的遷移行為，因此樣品堆積法中的場放大法並不 適用於固酮類分析物的分離，經過Terabe 以及許多科學家的努力研究 [57-72]，提出了適合中性分析物濃縮技術－正向堆積模式，並開發出在 微胞電動層析法下，數種不同的線上濃縮模式，如表2-2所示，以下介紹
本實驗過程中所採用的毛細管電泳掃集法 (sweeping-MEKC)。
表2-2 各種毛細管電泳線上濃縮的堆積模式
（Stacking with Reverse Migration Micells and Water Plug, SRW）
毛細管電泳掃集法
2-4.1 毛細管電泳掃集法
毛細管電泳掃集模式 ( sweeping-MEKC )，是先在毛細管中注滿低 pH 值、含有微胞的緩衝溶液或稱背景溶液 ( micellar backgrand solution, BGS )，然後進樣一大段含有樣品的基質 ( matrix )，再將毛細管柱兩端 置於BGS 溶液中，通入高壓電，就可以開始進行電泳層析[73]。
若實驗是採用陰離子型的界面活性劑，則須通以負向高壓電，由於 BGS 和 matrix 的導電度相同，且在酸性溶液中 (pH≦2)進行電泳時，
電滲流幾乎為零，在電場的作用下，微胞會由進樣端開始進入毛細管，
當微胞經過樣品基質區時，會與分析物結合，並帶領分析物一起往偵測 端的方向移動，此過程就稱為掃集法( sweeping )的MEKC線上樣品堆積 技術。
不同分析物和微胞的結合度並不相同，與微胞結合度越強的分析 物，被掃集的效果就越好，相對的，與微胞結合度差的分析物，所堆積 而成的譜帶較寬，分離效率較差。以最佳線上濃縮條件下的堆積效率 ( stacking efficiency, SE )，來表示分析物被堆積的程度，就偵測靈敏度而 言，堆積效率每改善10 倍，相當於降低1 個級數的偵測極限，所以可以 從堆積效率，來判斷此堆積的技術是否有效地提高偵測靈敏度。
堆積效率又可以分為譜峰高度堆積效率( SEH )及譜峰面積堆積效率 ( SEA )兩種。計算方法如下︰
SEH＝Hsweeping / H3S SEA＝Asweeping / A3S
其中Hsweeping 及Asweeping 分別是使用掃集法所得到的譜峰高度和面
積，而H3S及A3S分別是進樣3秒條件下相對的譜峰高度和面積。當進樣時
一般而言，利用毛細管電泳掃集法比一般微胞電動層析法，約可降低大 約3~4 個級數的偵測極限，適合用來改善紫外光偵測器在低濃度的樣品 分析時，無法偵測到訊號的缺點。