4-1 色胺類物質的光譜性質
本實驗的研究目的是針對九種色胺類物質，希望開發出一個快速而有效 的分離方法，並藉由不同的方法找出其最低分析量，依據九種色胺類物質的 紫外光/可見光吸收光譜圖中，可分成兩組吸收波長；第一組為:5-MeO-DiPT、
5-MeO-AMT、5-MeO-DMT等三種分析物，其最大吸收波長約為275 nm，第 二組為: DBT、DPT、DiPT、DET、AMT、DMT等六種分析物，其最大吸收 波長約為280 nm，因此本實驗採用較多數分析物的最佳的吸收波長280 nm，
如圖4-1所示。
9
9 99
235 255 275 295 315 335
Wavelength (nm) 圖 4-1 分析物紫外光/可見光吸收光譜圖
(1) DBT (2) DPT (3) DiPT (4) 5-MeO-DiPT (5) DET (6) AMT (7) 5-MeO-AMT (8) DMT (9) 5-MeO-DMT 濃度皆為 10 ppm 1
9
Signal In ten sity
4-2 微胞電動層析法 ( Micellar electrokinetic chromatography, MEKC ) 的最佳化條件
將200 mM NaH2PO4配成的水溶液(以磷酸調配成pH為2.1的緩衝溶液)，做 為樣品基質 ( matrix )，再把分析物質溶於樣品基質中形成50 mM NaH2PO4水溶 液備用；並利用適當濃度的SDS為界面活性劑，再以磷酸配成pH為2.1的緩衝溶 液，進行微胞電動層析法分析，可以成功的將濃度 2 ppm的九種色胺類物質分 離。為了求得最佳的分離條件，以下討論幾個影響毛細管電泳分離效果的因素︰
(一) 毛細管內徑︰
一般而言，毛細管內徑越細，分離效率越好，比較75μm和50μm兩種 不同內徑的毛細管，結果發現內徑50μm的毛細管堆積效果較佳，因此實驗 過程均採用內徑50μm的毛細管。
(二) SDS濃度︰
本實驗分別配置含50、75、100 mM SDS之 50 mM NaH2PO4溶液，加入 Water-Methanol-Acetonitrile (H20:MeOH:ACN=65:30:5, v/v )，並以磷酸調整pH 至2.1作為分析時之緩衝溶液。如圖4-2所示，當SDS濃度為 100 mM時，九種 物質譜峰無法完全分離，若將SDS濃度降低為75 mM時，即可在45分鐘內將 九種物質完全分離出來。當SDS濃度降低為50 mM時，雖然依然可以完全分 離，但解析度卻明顯下降且分離時間也加長。所以本實驗選擇75 mM SDS為 最佳分離條件。
(三) NaH2PO4濃度︰
低pH值的溶液環境降低了毛細管壁的矽醇基效應，抑制電滲流 ( EOF ) 的干擾，使分析物之微胞得以依其自身的電泳遷移速率進行分離。本實驗配
(v/v)，並以磷酸調整pH至2.1作為分析時之緩衝溶液。實驗結果發現NaH2PO4 濃度對分離效果影響不大，基於NaH2PO4濃度越大電流會越大的事實，為避 免電流過大對儀器或毛細管可能造成的傷害，所以本實驗選擇50 mM
NaH2PO4為樣品基質 ( matrix ) 來配製緩衝溶液。
(四)有機溶劑組成︰
毛細管電泳分離技術中常可見利用加入不同有機溶劑組成，以改變分析物 與毛細管壁間相互作用力，藉此達到最佳的分離效果。本實驗以固定75 mM SDS、50 mM NaH2PO4 、65﹪Water，及改變緩衝溶液中不同有機相組成
( ACN-MeOH共35﹪﹐v/v) 的混合溶液進行實驗條件分析。從圖4-3可看出，當 緩衝溶液組成只含有 H20:MeOH (70:30,v/v ) 時，九種物質譜峰分離效果不佳，
但調整 H20:MeOH:ACN ( 65:32.5:2.5﹐v/v)才可使九個譜峰完全分離，因此為期 達到最佳分離條件，本實驗調整ACN體積比例，將H20:MeOH:ACN (v/v)比例分 別調整為 65:32.5: 2.5、65: 30:5、65:27.5:7.5、65:25:10四種不同比例，當 H20:MeOH:ACN為(65:30:5, v/v )有最佳的分離效果。
綜合以上結果，本實驗分析方法的緩衝溶液(buffer)組成為75 mM SDS、50 mM NaH2PO4溶液，加入H20:MeOH:ACN為(65:30:5, v/v )後，並且 以磷酸調整pH至2.1，以50μm毛細管全長為80 cm，到偵測窗為67 cm ，在
－15kV電壓下，電流約－30μA，於45分鐘內可將九種分析物完全分離。
圖 4-2 不同SDS濃度的分離效果比較 A: 50 mM SDS ，～－35μA B: 75 mM SDS ，～－30μA
C: 100 mM SDS ，～－20μA
50 mM NaH2PO4 ，H20:MeOH:ACN= 65:30:5(pH=2.1) 電壓 : －15kV /λ= 280nm
毛細管:50μm / 67 cm/ 80 cm
(1)DBT (2) DPT (3) DiPT (4) 5-MeO-DiPT (5) DET (6) AMT (7) 5-MeO-AMT (8) DMT (9) 5-MeO-DMT 以上樣品濃度 皆為 1 ppm
0.8V
10 20 30 40 50
* *
* *
A
B
C * *
1
2 3 4 5 6 7 8 9
Migration Time (min.)
Signal In ten sity
Migration Time (min.)
圖 4-3 不同體積百分組成的有機溶劑對分離效果的影響 A: H20:MeOH ( 70:30﹐v/v ) ，～-30uA
B: H20:MeOH:ACN ( 65:32.5:2.5﹐v/v)，～-30uA 75 mM SDS，50 mM NaH2PO4 ( pH= 2.1 )
電壓 :－15KV /λ= 280nm 毛細管:50μm / 67 cm/ 80cm
(1)DBT (2)DPT (3)DiPT (4)5-MeO-DiPT (5)DET (6)AMT (7)5-MeO-AMT (8)DMT (9)5-MeO-DMT 以上樣品濃度皆為
4 ppm
15 30 45 A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Signal In ten sity
4-3 微胞電動層析法(
Micellar electrokinetic chromatography, MEKC) 分離條件的適宜性評估
4-3.1 檢量線製作
在最佳化條件下，配製不同濃度的九種色胺類物質樣品，濃度分別皆為 2 ppm、8 ppm、20 ppm、50 ppm，計算譜峰面積對不同濃度作圖，得到檢量線 關係，且將所得譜峰面積做成檢量線，其R2皆達0.9900以上，如圖4-4 ( DBT ) 及 表4-1所示；表示微胞電動層析法對九種色胺類物質在此濃度範圍下的偵測，
具有不錯的線性關係。
圖 4-4 微胞電動層析法不同濃度與譜峰面積檢量線關係圖
分析物: N,N-dibutyltryptamine ( DBT ) 2 ppm、8 ppm、20 ppm、50 ppm BGS : 75 mM SDS，50 mM NaH2PO4/ H2O:MeOH:ACN= 65:30:5
( pH= 2.1 ) Matrix : 50 mM NaH2PO4/H2O
毛細管: 50 um/ 67 cm/ 80 cm
電壓:－15 kV，－30 μA，λ= 280 nm
y = 1.44 X 104x + 5.97 X 103 R2 = 0.9987
0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000
0 10 20 30 40 50 60
ppm
area
表4-1微胞電動層析法對分析物之不同濃度與譜峰面積檢量線關係表 分析物 直線方程式 R2
DBT y = 1.44 × 104x ＋ 5.97 × 103 0.9987 DPT y = 1.20 × 104x ＋ 1.70 × 104 0.9998 DiPT y = 2.24 × 104x － 5.72 × 102 0.9934 5-MeO-DiPT y = 1.79 × 104x ＋ 2.20 × 104 0.9972 DET y = 1.59 × 104x ＋ 2.33 × 104 0.9988 AMT y = 2.04 × 104x ＋ 5.10 × 104 0.9960 5-MeO-AMT y = 2.09 × 104x ＋ 4.35 × 104 0.9906 DMT y = 2.33 × 104x ＋ 5.20 × 104 0.9969 5-MeO-DMT y = 1.90 × 104x ＋ 7.05 × 104 0.9922
*分析物濃度皆為: 2 ppm、8 ppm、20 ppm、50 ppm
*其它電泳條件如圖 4-4
4-3.2 再現性的探討
為了確定微胞電動層析法是否具有良好再現性，我們使用以下兩種 計算方式，一是同一天的相對標準偏差( intraday RSD )，另一種是不同天 的相對標準偏差( interday RSD )。本實驗採用同一天內重複四次
( intraday )與不同天內重複四次 ( interday )測試，觀察分析物的遷移時間 及譜峰面積是否具有良好的再現性。
依據表4-2列出所得數據，可以得知九種色胺類物質樣品遷移時間同一 天內的相對標準偏差都小於 2％，有不錯的再現性，對於譜峰面積的相對 標準偏差略高一點，但皆小於 10％的範圍內，但不同天內的樣品遷移時間 相對標準偏差較同一天的為高，但是都小於 6.2％，對於譜峰面積的相對標 準偏差與同一天內比較並無太大差異，皆小於 10％的範圍內。由實驗數據 可知九種色胺類物質樣品遷移時間的相對標準偏差大多小於5％，表示再現 性不錯；但在譜峰面積再現性的相對標準偏差都略高許多；推論會有此現 象發生的原因，可能是實驗中樣品注入採取靜力虹吸進樣的方式，將注入 端以手提高相對於接地端約40 cm高，停留3秒鐘，利用虹吸現象將樣品注 入，但在人為操作時高度及時間會有些微的變化，結果造成進樣量的不同，
因此造成譜峰面積再現性略差。
表4-2 微胞電動層析法對DBT、DPT、DiPT、5-MeO-DiPT、DET、AMT、
5-MeO-AMT、DMT、5-MeO-DMT的分析再現性( RSD％ )(皆為 2 ppm ) Intraday ( n=4 )
Time Area
Interday ( n=4 ) Time Area
DBT 1.01 5.74 1.77 7.47
DPT 0.46 8.78 2.75 3.01
DiPT 0.40 9.18 3.26 6.31
5-MeO-DiPT 0.27 9.61 3.79 9.34
DET 0.28 8.23 4.31 9.09
AMT 0.61 8.87 4.86 5.72
5-MeO-AMT 0.68 6.62 5.69 8.19
DMT 1.11 9.27 5.82 9.32
5-MeO-DMT 1.29 5.14 6.17 2.79
4-3.3 偵測極限
我們經由不斷測試後，找出最佳微胞電動層析法條件，接著進行九種色 胺類物質樣品的濃度稀釋偵測，以求出偵測極限。在最佳化條件下，樣品 注入採取靜力虹吸進樣的方式，將注入端以手提高相對於接地端約40 cm高 度，停留3秒鐘後，利用虹吸現象將樣品注入，接著通入負高壓電，以S/N
＝3 的條件進行毛細管電泳圖譜，所求出的偵測極限分別如下:
DBT ( 0.23 ppm )、DPT ( 0.40 ppm )、DiPT ( 0.34 ppm )、5-MeO-DiPT ( 0.80 ppm )、DET ( 0.45 ppm )、AMT ( 0.26 ppm )、5-MeO-AMT ( 0.56 ppm )、DMT ( 0.43 ppm )、5-MeO-DMT ( 0.67 ppm )。
4-4 毛細管電泳掃集法 ( sweeping- MEKC ) 的最佳化條件
4-4.1 溶液的製備
(一)緩衝溶液 ( buffer )
依照微胞電動層析法找到最佳化分析條件所使用的緩衝溶 液，再以磷酸配製成pH=2.1 的溶液。
(二)樣品基質 ( matrix )
配製與緩衝溶液組成相似，但不含界面活性劑 SDS 的溶液，
以此作為稀釋待測物質之樣品基質。
(三)分析物
將待測分析物質溶於已配製好的樣品基質中，配製成所須的不同分 析物質濃度，進行毛細管電泳掃集法分析。
(四)虹吸時間的測量
由於本實驗使用的是自組式電泳分析儀，所以無法使用壓力注入的 方式進樣，因此採用靜力注入的方法，將注入端提高，相對於接地端40 cm 的高度，利用虹吸現象使樣品注入。
實驗之初，為量測注入樣品至偵測窗所須時間，因此先以樣品基質 溶液稀釋DiPT 至 10 ppm 為分析樣品，以靜力注入的方式進樣，其得到的 結 果 ， 如 圖 4 - 5 所 示 ， 代 表 由 注 入 端 至 偵 測 窗 距 離 6 7 c m ， 約 需花費2210 秒才會到達偵測窗。依此我們便可以推論出樣品在以靜力注入 的 方 式 進 樣 時 ， 其 流 速 約 為 1 . 8 1 8 c m / m i n . ， 之 後 我 們 可 以 作 為 改變進樣時間量測的重要依據。
(五)樣品注入流程
分離開始之初，先將毛細管注滿分離用緩衝溶液，再以靜力虹吸 進樣方法選擇所需時間，注入一段樣品溶液，隨後加上負高壓電進行毛 細管電泳掃集法分離所分析物質。
圖4-3-a 虹吸時間的測量
20 30 40
Migration Time (min.)
Signal Intensity
圖 4-5 虹吸時間的測量
20 30 40
Migration Time (min.)
Signal In ten sity
4-4.2 最佳進樣長度的測量
樣品注入的長度越長，相對進樣的體積也就越多，有助於提高堆積效率，
但若進樣量過多，分析物可能會在未堆積前就通過偵測窗，因此需測試最佳 進樣長度。本實驗的樣品注射方式，是採用虹吸法進樣，將樣品端抬高，和 接地端相差40 cm，並測試樣品注入的速度，可計算出虹吸速率為1.818 cm/min.，如圖4-5 所示；本實驗使用改變虹吸進樣長度分別為31.8 cm、
36.4cm、40.9 cm、49.9 cm、59.1 cm，進行電泳層析，可以得到不同的堆積效 率，如圖4-6 所示，從圖中我們可以發現當最佳進樣長度為40.9 cm時，可得 到最大的理論板數與最佳的分離效率。若我們繼續增加進樣長度，則樣品被 掃集的區帶加大，反而使各分析物的譜峰半高寬增加，因此會出現理論板數 下降及分離效率變差的情形。
圖 4-6 毛細管電泳掃集不同進樣長度分離層析圖 進樣長度: (A) 31.8 cm (B) 40.9 cm (C) 49.9 cm (D) 59.1 cm
分析物 : (1) DBT (2) DPT (3) DiPT (4) 5-MeO-DiPT (5) DET (6) AMT (7) 5-MeO-AMT (8) DMT (9) 5-MeO-DMT 濃度皆為 1 ppm BGS :75 mM SDS，50 mM NaH2PO4/H2O:MeOH:ACN=65:30:5
(pH=2.1) Matrix : 50 mM NaH2PO4/H2O
20 22 24 26
Migration Time(min.)
Signal Intensity C
D *
*
23 26 29 32 35 38 41 Migration Time(min.)
Signal Intensity
** A
B
1 2
3 4 5 6 7 8 9
4-5 毛細管電泳掃集法( sweeping-MEKC)分離條件適宜性評估
4-5.1 檢量線製作
配製不同濃度的九種色胺類物質樣品，濃度分別皆為 1/2 ppm、1/8 ppm、
1/32 ppm、1/64 ppm，在最佳掃集條件下，樣品靜力虹吸進樣長度為40.9 cm，
再進行負高壓電掃集，計算譜峰面積對不同濃度作圖，且將所得譜峰面積做成 檢量線，其R2皆達0.9900以上，得到檢量線關係，如圖4-7 ( DBT ) 及表4-3所 示；表示毛細管電泳掃集法對九種色胺類物質在此濃度範圍下的偵測，具有不 錯的線性關係。
圖 4-7 毛細管電泳掃集不同濃度與譜峰面積檢量線關係圖
分析物: N,N-dibutyltryptamine (DBT) 1/2 ppm、1/8 ppm、1/32 ppm、
1/64 ppm
BGS : 75 mM SDS，50 mM NaH2PO4/ H2O:MeOH:ACN= 65:30:5 ( 以 H3PO4調pH 至 2.1) Matrix : 50 mM NaH2PO4/H2O
毛細管: 50 um/ 67 cm/ 80 cm，進樣時間: 1350 秒( 40.9 cm ) 電壓:－15 kV，－30 μA，λ= 280 nm
y = 5.99 X 106x - 4.38 X 104 R2 = 0.9939
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
ppm
area x 106
表4-3 毛細管電泳掃集法對分析物之不同濃度與譜峰面積檢量線關係表 分析物 直線方程式 R2
DBT y = 5.99 × 106x － 4.38 × 104 0.9939 DPT y = 8.11 × 106x ＋ 3.54 × 104 0.9981 DiPT y = 8.04 × 106x ＋ 1.37 × 105 0.9979 5-MeO-DiPT y = 7.89 × 106x ＋ 4.63 × 104 0.9984 DET y = 9.35 × 106x ＋ 4.58 × 104 0.9992 AMT
y = 1.18 × 107x ＋ 2.12 × 105 0.9973 5-MeO-AMT y = 1.25 × 107x ＋ 1.63 × 105 0.9982 DMT y = 1.39 × 107x ＋ 2.62 × 105 0.9962 5-MeO-DMT
y = 1.41 × 107x ＋ 4.01 × 104 0.9984
*分析物濃度皆為: 1/2 ppm、1/8 ppm、1/32 ppm、1/64 ppm
*其它電泳條件如圖 4-7
4-5.2 再現性的探討
為了確定毛細管電泳掃集法( sweeping- MEKC )是否具有良好再現 性，我們使用以下兩種計算方式，一是同一天的相對標準偏差( intraday RSD )，另一種是不同天的相對標準偏差( interday RSD )。本實驗採用同一
為了確定毛細管電泳掃集法( sweeping- MEKC )是否具有良好再現 性，我們使用以下兩種計算方式，一是同一天的相對標準偏差( intraday RSD )，另一種是不同天的相對標準偏差( interday RSD )。本實驗採用同一