研究材料與方法
第一節 研究對象
本實驗是選取 60 隻發育中 Long-Evans 品種雄性大鼠，30 天年齡大，
體重約為 120 公克重。 隨機分成四組(Groups I~IV)、每組 15 隻，其中 三組為實驗組、另外一組為控制組。
第二節 研究材料
本實驗是使用肉毒桿菌素 A 型(BOTOXR, Allergan Pharmaceuticals, Ireland)，每一小瓶 100 U，添加無菌 0.9%生理食鹽水 4.0ml 作為稀釋劑，
調配成 25U/ml 濃度的製劑。
第三節 研究設計及步驟
一． 全身麻醉與肉毒桿菌素注射
利用腹腔注射(intraperitoneal, IP)方式，以 Zoletiel (1ml/kg) 麻醉 劑和 Rompun (0.5ml/kg)肌肉鬆弛劑兩種藥劑將大鼠麻醉，而後將 25U/ml (≈9U/kg body mass,Ulgen M.,1997)之肉毒桿菌素 A 型 (BOTOXR, Allergan Pharmaceuticals, Ireland)，依部位隨機分成四組，
其中三組為實驗組、另外一組為控制組，依部位注射入大鼠:
◎ Group I (Mb+Tn.s.) 雙側咬肌 (顳肌則注射入等量生理食 鹽水)。
◎ Group II (Mn.s.+Tb) 雙側顳肌 (咬肌則注射入等量 生理食鹽水)。
◎ Group III (Mb+Tb) 雙側咬肌和顳肌。
◎ Group IV (Control) 雙側咬和顳肌注射入等量生理食 鹽水。
甲、 顳肌(temporalis muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:
1. 大鼠兩側眼框至耳朵間剃除毛髮。
2. 在眼框與外耳道連線之 1/3 與 2/3 處，作上記號，此為施打顳肌 之進針點。
3. 於針頭上裝置 plastic stopper，針頭露出 3.5 mm，使進針量固定。
進針時，斜面朝下，碰到骨頭後停止，接著施打藥劑，每注射 點施打 0.5U 之藥劑，故每側每塊肌肉共注射 1.0U 之肉毒桿菌 神經毒素。
乙、 咬肌(masseter muscle)注射肉毒桿菌素之步驟:
1. 大鼠兩側臉頰剃除毛髮。
2. 在眼框與外耳道連線之中點處、垂直於口裂與下顎骨角連線 處，作上記號，此為 superficial masseter muscle 之進針點。
3. 在眼框與外耳道連線之眼眶後緣、垂直於口裂與下顎骨角連線 處，作上記號，此為 deep masseter muscle 之進針點。
4.於針頭上裝置 plastic stopper，針頭露出 3.5 mm，使進針量固定。
進針時，斜面朝下，碰到骨頭後停止，接著施打藥劑，每注射點 施打 0.5U 之藥劑，故每側每塊肌肉共注射 1.0U 之肉毒桿菌神經 毒素。
二． 大鼠的飼養
麻醉清醒後，大鼠將飼養於台北醫學大學動物實驗中心， 飼養 環境維持室溫 23℃，溼度 55%，自由飲水飲食。 食物成分為福壽牌 鼠科飼料，其成分為粗蛋白 23.5%以上，粗脂肪 4.5%，粗纖維 6%，
水 12%，灰份 9%。飼養天數為 45 天。
三． 大鼠的犧牲與灌流手術
45 天後，將 75 天年齡大的大鼠用過量的 Zoletiel 麻醉劑和
流手術。
四． 肌肉重量之量取
手術取下大鼠咬肌與顳肌，用電子天秤(brand)量取咬肌與顳肌的 重量，比較四組之間咬肌和顳肌重量之差異。
五． 乾燥頭顱骨之骨密度(Bone Mineral Density)測量 將大鼠頭顱骨製作成乾燥頭顱骨(dry skull)，以 DEXA
(Dual-energy X-ray absorptiometry)量測左右半部的下顎骨及頭顱骨 之骨密度，比較四組間雙策下顎骨與頭顱骨之骨密度差異。
六、 下顎骨 cortical bone(皮質骨)厚度之測量:
將所有樣本之右側下顎骨經過脫鈣脫水步驟，製作成骨切片標 本，並在光學顯微鏡(Zeiss, AxioScop 2)下，放大 25 倍觀察選取之測量點 之皮質骨厚度。在各部位之視野下照相攝影（Zeiss, AxioCam ，於攝影得 道之圖片中以圖像軟體（Zeiss, AxioVision）測量選取測量點之皮質骨厚 度並紀錄。測量點之選取部位如後頁所述。
◎骨切片標本之脫鈣與脫水之程序如下：
1. 以 TBD-2 脫鈣液浸泡 12 小時以上。(脫鈣液成分：氧化鋁、鹽酸、蟻 酸)
2. 將骨骼組織以水洗一小時。
3. 以 PH10 之中和液(0.5%硫酸鈉溶液)浸泡一小時。
4. 將骨組織標本依序置入 70%、80%、95%酒精中一小時以上，再置入 100%
酒精中三次，每次一小時，進行脫水。再浸入 Xylene 兩小時。
5. 置入 60 度 C 的液態石蠟中三次，每次一小時，進行包埋。
6. 切片約 5-7μm，至於以塗抹 albumin 乾燥之玻片上。37 度 C 下烘乾。
7. 以 Hematoxyline 與 Eosin 染色，再經 70%、80%、95%、100%之酒精脫 水。
◎於下顎骨兩處做切片之定義如下：
將 mandibular body 之 incisal alveolar process 之最低緣與 angular process 之 最低緣切點相連作為橫軸。 以下 A 與 B 選取點皆以垂直此橫軸方式做切片。
Incisal alveolar process 最低緣 angular process 之最低緣
A.1stMolar central cusp
B. Coronoid process 頂點
A. 第一大臼齒中央牙埠(1st molar central cusp)向下：觀察臼齒區之 齒槽骨至下顎骨下緣之皮質骨厚度。其橫斷面再選取四點測量皮質骨 厚度。
A1：由 masseteric ridge 最突出點且垂直皮質骨表面之皮質骨厚度。
A2：由 mandibular canal 之最上緣作切線垂直外側皮質骨表面之皮質骨厚 度。
A3：由 mandibular canal 之最上緣作切線垂直內側皮質骨表面之皮質骨厚 度。
A4：經過 incisal alveolar process 之最低點向內與 incisal socket 內緣 的切線垂直之皮質骨厚度。
B. 由冠狀突(coronoid process)頂點向下至下顎骨下緣：因顳肌附著於 冠狀突，咬肌附著於下顎骨下緣，可觀察此兩處的皮質骨厚薄。其橫 斷面再選取四點測量皮質骨厚度。
B1：垂直內外側之皮質骨表面，於 coronoid process 之最突出處。
B2：垂直內外側之皮質骨表面，於 coronoid process 頂點至 mandibular canal 上緣之中點。
B3：垂直內外側之皮質骨表面，mandibular canal 下緣至 condylar costa 頂點之中點。
B4：由內側 Pterygoid ridge 至 mandibular border 最外側突出點之皮質骨 厚度。