由於本研究的四個實驗中所使用的受試、行為工具、神經系統操弄及統計方 法等項，均有共同內容。本章先就此部分進行說明，各個實驗的細節步驟則呈現 於後續的各個實驗章節中。
第一節、受試者
本實驗採用Wistar 品系之雄性大白鼠，其年齡約 10 至 12 週。受試自國立 台灣大學醫學院實驗動物中心購回後，便飼養於生理心理實驗室動物房內之不鏽 鋼鐵個別鼠籠內，並於實驗全期供應充分的食物及飲水。飼養房內設定12/12 小 時的晝夜週期（早上7:30 到晚上 7:30 為光照期），室溫維持在 22 ± 2℃。實驗進 行均維持在晝間，約從早上十點到下午五點。本研究的相關動物實驗步驟及流 程，係經過國立政治大學動物實驗管理小組審核通過後執行之，受試的使用與照 料均遵循行政院農委會頒佈有關動物實驗規定的相關條例，並參考美國National Institute of Health (NIH)的相關規定。
第二節、工具
本研究所使用的禁錮壓力源為一透明的壓克力（厚0.5 cm）製圓柱型透明 罐，其直徑為8 公分，長為 18 公分，其兩端之面版各有一個小洞（直徑 1.5 cm）
供透氣之用。
本研究所採用的場地制約偏好行為測試儀器，係由三個壓克力製箱子構成，
包含兩個側箱(各為 45 cm × 45 cm × 45 cm)以及一個中間穿梭箱( 20 cm × 10 cm
× 12 cm)。兩個側箱中的一個，其牆壁為寬五公分黑白相間的條紋，另一側箱牆
側箱的地板為條狀鐵條（0.2 cm）平行排列，相距間隔 0.5 公分；而灰白側箱內 的地板則為網狀鐵架，其每一個正方形網格的邊長為0.5 公分。除上述牆壁及地 板在兩側箱的不同建構外，另在黑白條紋側箱中放置白醋做為嗅覺線索，而灰白 條紋箱則未置任何嗅覺刺激。
本研究使用了兩種類型的自發性行為活動量測試儀器。實驗一及二中，所使 用的測試儀器包含一黑色壓克力箱( 35 cm ×35 cm × 35 cm)及感知光耦合元件
（Charge Coupled Device, 簡稱 CCD）等。CCD 架設在距離黑色壓克力箱底部 52 公分高的支架上，其功能可以追蹤實驗受試在壓克力箱內的位置。此儀器可 記錄的依變項指標為「行進距離」，係指實驗動物於實驗期間在壓克力箱內的行 走移動總距離，其記錄單位為公釐(mm)。本研究實驗三所使用的另一類型自發 性活動量測量，乃是在一個與飼養籠物理特徵不同的白色塑膠材質測試箱( 43cm
× 23cm × 20cm)中裝設有一紅外線動作量偵測器(Infrared Motion Activity
System，Coulbourn Instrument Co.; U.S.A.製)。此設備共可測得四種活動量的指 標：一、小動作次數(number of small movements)：定義實驗受試的動作持續時間 小於1 秒者為小動作，並記錄測量時間 30 分鐘內小動作發生的總次數；二、小 動作持續時間(duration of small movements)，指測量時間內所有小動作發生時間 的總和；三、大動作次數(number of large movements)，定義動作持續時間大於 1 秒者視為大動作，紀錄在測量時間內大動作發生的總次數；四、大動作持續時間 (duration of large movements)，指測量時間內所有大動作發生時間的總和。
本研究所使用的抬高式T 型迷津，其係由三個相同面積尺寸（50cm × 10cm）
及厚度為1.5 公分的木板所構成，其中一木板與另外兩片直線連接木板垂直構成 T 字形狀。T 形迷津直向的木板三面周圍由 40 公分高的木板封住，稱為封閉區；
另外兩個橫向連結接臂型木板，除連接區域靠封閉區域對側之十公分中央區域有 40 公分高牆外，其餘週緣則無任何封牆，稱為開放區。整個迷津以角架抬高離 地面50 公分。
第三節、場地制約偏好行為的訓練步驟
場地制約行為訓練程序共進行三天，分別是制約前測、習得及制約後測等 三個階段。在第一天的制約前測中，分別進行上午及下午的兩次嘗試。每次嘗試 開始時將受試輕置於制約箱的中間穿梭箱中，任其自由探索整組儀器10 分鐘。
實驗者操作電腦鍵盤記錄受試進出左右側制約箱的次數及停留時間，進入特定的 側箱之觀察標準依受試的四肢全部進入該箱內為準，由電腦自動執行程式累計停 留時間。此階段的目的在於讓受試探索整組測試儀器的環境，並將兩次的探索時 間平均供實驗者決定每一受試的制約箱選擇參考依據。本實驗採取非偏誤設計 (unbiased design; Carr et al., 1989)，並依據前測結果進行對抗平衡設計
(counterbalance)即一半受試接受壓力源與原先較偏好的制約箱做配對制約，另一 半受試則為壓力源與原先較不偏好的制約箱作配對制約。在第二天的習得階段，
受試在下午接受壓力源與特定側箱配對制約，而早上則進行無壓力源與另一側箱 的配對制約。每個受試只接受前述「有」與「無」的壓力源操弄之制約訓練各一 次，每次的時間為30 分鐘。相對於實驗組的受試，控制組受試進行相同的程序，
但不接受任何壓力源操弄，即此階段的上下午兩次置入不同側箱均無壓力源操 弄。第三天為制約效果的後測階段，實驗者將受試輕置於儀器的中間穿梭箱內，
任其自由活動於整組制約箱中10 分鐘。實驗者記錄其進入兩側制約箱中的停留 累計時間，受試在此階段並不接受任何壓力源的操弄。
第四節、腦部埋管手術
實驗受試首先接受腹腔注射複合型麻醉劑舒泰50(Zoletil 50; Virbac
Laboratories, France)。待實驗受試麻醉後先剃除其顱毛，再固定於腦部立體定位 儀(stereotaxic apparatus，DKI-900)上。頭部消毒後，切開頭皮並去除結締組織，
使頭蓋骨露出，以囪門(bregma)作為定位座標的原點。依據 Paxinos 和 Watson(2005) 之圖譜，定出內側前額葉皮質座標為AP:＋2.7 mm, ML :± 0.7 mm, DV:－5.5 mm，並計算目標神經核位置上方 1.5 mm 的立體座標，再以牙科電鑽鑽開雙側 目標神經核上方的頭骨，將雙側鋼管（規格為23G：外徑 0.63 mm，內徑 0.33 mm）
緩緩地植入到正確位置，最後將埋入的兩隻鋼管以牙科膏(dental cement)固定於 拴在頭骨上的三根小螺絲釘上。手術完成後於實驗動物大腿肌肉注射0.2 毫升的 抗生素(penicillin, 20,000IU)，以減少傷口可能引發的發炎感染。實驗受試在手術 後經過一週的復原期才進行場地制約偏好行為測試程序。
第五節、藥物
本研究使用的藥物為SCH23390、raclopride、yohimbine 及二丁卡因(lidocaine hydrocholoride)(Sigma chemical Co., St. Louis, Mo., USA)等。上述四種藥物均在實 驗使用前，以生理食鹽水(0.9% NaCl)作為溶媒依實驗所需的劑量進行泡製。
第六節、藥物顱內注射
實驗受試接受中樞微量注射藥物時，以注射針（規格31 號）用聚乙烯管(PE20) 連接於微量注射筒(Hamilton microsyringe, 2μl)之上。在注射之前先將聚乙烯管和 注射筒吸滿生理食鹽水，再將欲注射的藥物由注射針吸入聚乙烯管內，並以一小
時，先將實驗受試適度握住，並取出原留置於鋼管中預防阻塞的細鋼針後，將注 射針插入鋼管，並使其針頭突出所埋鋼管底部1.5 mm，然後以緩慢推動的方式 同時將藥物溶液注射入兩側的鋼管注入目標區中。注射速率為每分鐘0.25 μl，藥 物注射完後，把注射針流置於鋼管原處一分鐘之後，再將注射針緩緩取出，以使 藥物充分擴散於目標區中。
第七節、壓力賀爾蒙皮質醇酵素免疫分析之測定步驟
將皮質醇抗體以吸附緩衝液混和均勻後吸附於96 槽微滴盤中，每槽需加入 200μl，於室溫下震盪 30 分鐘後，置於 4℃環境中隔夜，此為固相載體。經 24 小時抗體吸附完全後，以清洗緩衝液將多餘未被吸附之抗體洗去。加入填塞緩衝 液300μl 以填充未經抗體吸附之固相，經室溫震盪 30 分鐘後以膠膜密封，置於 4℃
環境中一天後即可進行測試。
進行皮質醇抗原與標誌酵素抗原之競爭反應測試前，取出微滴盤回溫30 分 鐘並以清洗緩衝液清洗二次，加入以分析緩衝液稀釋過後之皮質醇標準液及檢體 各50μl，隨即加入 150μl 之皮質醇結合酵素抗原(cortisol-horseradish peroxidase, F-HRP)。於室溫下震盪 20 分鐘後再以清洗緩衝液清洗。待微滴盤沖洗完畢後，
隨即加入200μl 的 OPD (o-phenylene diamine)作為呈色受質，並於室溫下震盪 20 分鐘進行避光呈色反應。最後於每槽加入50μl 的 8NH2SO4以停止呈色反應。
以ELISA reader 在 595nm 波長測其吸光值，判讀求出其標準液之吸光值。
當標準液濃度越低時其呈色越深，反之若標準液含量濃度越濃時，其呈色相對地 較淺；樣本之呈色即以標準液曲線呈色作為對照，相較之下得知樣本中皮質醇之 實際濃度。
第八節、組織切片
待所有行為實驗完成後，即進行灌流程序以進行腦組織切片檢驗。首先把實 驗受試的胸腔切開，剪開右心室使血液釋出，再由左心室注入0.9%的生理食鹽 水，直到血液幾乎被生理食鹽水取代後，再以24%的福馬林緩衝液(formalin buffer) 替代生理食鹽水灌入左心室，待受試眼球呈現白透明狀與肌肉僵硬變直。將受試 腦部剖出，並浸泡於保存液中，放入冰箱冷藏（至少三天）等待進一步切片。大 腦保存液乃是在165ml 純水中分別加入 100ml 的 24%福馬林、12.2 克蔗糖及一 顆生理食鹽水藥片(phosphate buffered saline tablet; Sigma chemical Co., St. Louis, Mo., USA)混合而成。待大腦硬化即進行切片及染色處理。切片時將鼠腦固定於 冷凍切片機(Leica, Jung CM1800)中，以 50μm 的厚度做冠狀切片(coronal
section)，依前後順序將取下的切片置於經蛋白膠處理(coating)的載玻片上。以 Cresyl violet 作為染料進行染色，只有手術埋管位置正確的受試的資料才進行統 計考驗。
第九節、統計分析
實驗一中的壓力賀爾蒙皮質醇變化量以及自發性活動量行為變化，分別以單 因子或是雙因子混合設計變異數(ANOVA)分析進行統計分析。抬高式 T 字迷津 的行為指標有抑制性逃避行為作業花費時間，以及脫逃行為花費時間等兩類行 為，實驗結果都以雙因子混合設計或是單因子變異數分析進行考驗。實驗二到四 的場地制約偏好行為作業的數據，以各組在兩側制約箱停留累計時間，以及各實
實驗一中的壓力賀爾蒙皮質醇變化量以及自發性活動量行為變化，分別以單 因子或是雙因子混合設計變異數(ANOVA)分析進行統計分析。抬高式 T 字迷津 的行為指標有抑制性逃避行為作業花費時間，以及脫逃行為花費時間等兩類行 為，實驗結果都以雙因子混合設計或是單因子變異數分析進行考驗。實驗二到四 的場地制約偏好行為作業的數據，以各組在兩側制約箱停留累計時間，以及各實