研究方法

現突變的好發頻率較高的區段（hot spots）（Tsai & Gill, 2006），因此所有14個exons 均要搜尋看是否有PCR產物，再經sequencing定序，去比對是否有突變序列或點位。

一、 研究對象 Subjects（Patients）

個案主要是由台大醫院內科黃天祥教授與小兒科蔡文友醫師的內分泌門診收 案，符合青春期性腺發育不全（血中性腺激素低下）、下視丘腦下垂體腺無解剖 學上之異常且嗅覺喪失（嗅球的MRI，發現嗅球萎縮或喪失），血液中濾泡刺激素 FSH與黃體素LH在正常範圍或是低下的Kallmann Syndrome卡曼氏症候群患者診 斷。本研究主要鎖定在KAL-1基因的突變搜尋，屬於性聯遺傳的卡曼氏症患者

（X-linked Kallmann Syndrome），一般而言會是以男性患者居多。經門診回診時，

告知詳情徵求同意參加研究者，在簽署（未成年者由監護人簽署）臨床研究同意

足，第二性徵不明顯，外生殖器短小，於民國84年10月21日轉至台大住院，經血 液內分泌檢查、核磁造影檢查、心理測驗檢查等，確診為卡曼氏症候群患者。個 案1（雙胞胎中之哥哥），不僅嗅覺喪失，從五歲因其智力溝通發展緩慢，才發現 其聽覺損傷，需戴助聽器，19歲時於台大施作心理測驗，WAIS智力測驗語言智商 68，操作智商84，總智商數73，介於智能不足邊緣，但不排除是因為從小聽力缺 損導致影響學習。個案2則智力正常，高中成績中等，大學聯考數學還達40分，除 了聽力正常外，其餘臨床表現與個案1同，兩位個案均長有「多發性骨性軟骨瘤」

（multiple exostosis）。個案1與個案2家族圖譜請參見圖1。

圖 1 個案 1 與個案 2 的家族圖譜

表 1 個案的臨床表徵與診斷

表1 個案的臨床表徵與診斷

個案3是一位25歲女性，青春期時無初經而來台大診斷為卡曼氏症。嗅覺喪失，左 耳自小聽覺不好。家族圖譜請參見圖2。目前已知個案3的哥哥也是符合卡曼氏症 診斷，但其個人並未同意進入本研究。

圖 2 個案 3 之家族圖譜

個案4是一位45歲男性，於35歲時因第二性徵不明顯，外生殖器短小，亦具有 男性女乳化特徵。來台大確診為卡曼氏患者。家族圖譜請參見圖3。

圖 3 個案 4 之家族圖譜

個案5是一位19歲男性，於民國78年剛出生時，於署立新竹醫院因外生殖器短 小與隱睪症狀轉診至台大，隱睪症狀後經手術使其睪丸正常沉降至陰囊中，但之 後睪丸發育仍有「男性假性雌雄同體陰陽人」（male pseudohermaphroditism）的表 徵，但腎臟超音波檢查兩側腎臟並無異常，經一連串檢查之後確診為卡曼氏症候 群患者。家族圖譜請參見圖4。

圖 4 個案 5 之家族圖譜

個案6為現年5歲多男性幼童，也是因為外生殖器短小與隱睪症狀至台大診 治，經確診為卡曼氏患者，其染色體數正常46，但在X染色體上p22.3位置多一段 染色體片段，應該是別處轉位（translocation）來的，其母親X染色體p22.3也是多 一小段，其父、外祖母染色體均正常，惟其外祖父有long Y。家族圖譜請參見圖5。

圖 5 個案 6 之家族圖譜

個案7為現年20歲男性，其因13歲青春期發育遲滯，14歲時仍然身材矮小而至 台大醫院診斷，經確診為卡曼氏症患者。其染色體為46，XY，9q12+，16qh+，long Y，第9號染色體上q12的位置，顯微鏡下染色質有稍微多一些，另外第16號染色體 q臂近中心點位置，也是顯微鏡下異質染色質（heterochromatin）有稍微多一點點；

Y染色體亦然。家族圖譜請參見圖6。

圖 6 個案 7 的家族圖譜

個案8為內科蔡克嵩醫師之病人，現年35歲已婚男性。於民國93年7月因咽膜 炎鼻漏不止求助台大，經MRI診斷才發現其蝶竇底部有先天缺陷，而造成腦脊髓液 鼻漏，經開刀以「蝶竇蝶鞍修補術」將其蝶竇底部組織修補好。住院期間因其MRI 檢查發現其蝶竇（sphenoid sinus）組織有疑似腦下垂體腺瘤（pituitary adenoma）

的跡象，為進一步確診，才發現其性發育不全，經蔡克嵩醫師診斷為卡曼氏症。

其性發育不全在蔡克嵩醫師門診持續補充雄性激素（testosterone），民國95年結婚，

希望能生育子女，於民國95年9月開始作「人類停經激素/絨毛膜促性腺激素」

（HMG/HCG）治療，期望能促進精子發育，但一直未能成功。家族圖譜請參見圖 7。

圖 7 個案 8 的家族圖譜

二、 人體 DNA 之萃取（Genomic DNA Extraction）

以EDTA為抗凝劑之5ml的真空採血管，採週邊靜脈血液檢體3ml全血，送實驗 室萃取DNA。檢體運送至實驗室之後，採用Qiagen Puregene DNA Blood Kit D-50K 試劑組萃取之。

將全血加入尖底塑膠離心管中，加入三倍體積之紅血球破壞溶液（RBC Lysis

Solution）上下搖晃混合10次，靜置5分鐘於室溫（15-25度C），讓RBC破裂溶解完 全。然後以2,000g（3,000rpm）離心10分鐘，讓白血球沉澱下來，小心倒掉上層液，

然後用殘留的溶液約200ul，加入Cell Lysis Solution 3ml混合，將白血球沉澱震動混 合均勻，以利白血球溶解破裂，另外再加入15ul的RNase A solution，上下搖晃混合 25次，置於37度C，15分鐘，再用冰浴降溫三分鐘。然後加入三分之ㄧ體積（1ml）

的蛋白質沉澱溶液Protein Precipitation Solution，高速強烈震動20秒，離心5分鐘於 2,000g（3,000rpm）。然後將上層液小心加入於盛有10ml体積的100%異丙醇 isopropanol新的乾淨離心管中。然後輕微上下顛倒搖晃50次直到有絲狀（DNA）產 生。然後再次離心5分鐘於2,000g（3,000rpm）。倒掉上層液，再加入70%的乙醇

（ethanol），上下搖晃數次去清洗（wash）DNA的沉澱物（pellet），離心5分鐘於 2,000g（3,000rpm），然後小心地倒掉上層液，將殘留液體吸乾，讓DNA pellet晾 乾至少5分鐘。回溶DNA於DNA Hydration Solution中，然後儲存於-20℃冰箱中保 存。

三、 聚合酶連鎖反應（PCR amplification）

按照（Georgopoulos, et al., 1997；Hardelin, et al., 1993）所記載聚合酶連鎖反 應PCR的條件，個案的Genomic DNA各取100ng當作聚合酶連鎖反應PCR的模板

（Template），用來擴增放大（amplification）KAL-1基因的14個exons的聚合酶連 鎖反應（PCR）合成產物DNA片段（amplicon）。而KAL-1基因的14個exons之每個 PCR反應所用的Primers序列則參考（Hardelin, et al., Table 2）所記載，參見表2。

PCR 反 應 的 溫 度 條 件 則 如 前 （ Georgopoulos, et al. ） 文 獻 所 描 述 的 ： 94°C denaturation，30秒；60°C annealing（除了exon 1在此步驟為63°C；exon 14在此步 驟溫度為55°C外，其餘exon 2-13均在60°C annealing，30秒，以避免反應產生大分 子量的雜band產物）；72°C extension，30秒；總共31個循環cycles。Primers 使用

100 nM 的濃度each。針對exons 1 與10，PCR反應條件須要加入10% DMSO，以避 免在擴增exon 1產物時會有次級結構產生，而在擴增exon 10時會與Y染色體上 homologous的pseudogene產生非專一性結合。此 protocol 的 modification 理由簡 略說明如下：

1. 原條件會有雜 bands 產生。Primer dimers 殘留。見圖 8。

結果 14 個 exons PCR 產物的 agarose 電泳膠圖（見圖 8），顯示除了 exon1 會在 175bp、300bp 以上各有一產物外，exon 2、4、5、6、7 則在產物的 後面有雜 bands，exon 11 則在產物前端有一依稀可見的較短之雜 band，顯 然需要提高 annealing 溫度，或是縮短一點反應溫時間；所有各 lane 產物 最前端有霧狀 primer dimers 殘留，可能亦需要增多循環 cycles 數，或是調 低 primer 加入的濃度量。 左右的長度。顯示該兩條產物，應該是在 exon1 此 primer pairs sequence 與 溫度條件下之現象。

圖 8 按照（Hardelin, et al., 1993）所載 PCR thermal cycle 條件之 KAL-1 基因 14 個 exon PCR 產物電泳圖

若按照（Hardelin, et al., 1993）所載 PCR thermal cycle 條件如下：

各 exon primer 濃度 conc.用 250nM 94°C denaturation, l min；

55°C annealing, l min；（exon 1 在此步驟為 63°C）

72°C extension, l min；

總共 30+1 個循環 cycles

Exon 1 & 10 with 10% DMSO added

表 2 Hardelin et al., 1993 所載 KAL-1 gene 14 個 exons PCR 時所用之 primers pairs

圖 9 增多循環 cycles 數、縮短反應時間以減少雜 bands 產生與 primer 的殘留。

3. 提高 annealing 溫度，以減少雜 bands，及比較 DMSO 加與否的差異。見圖 10。

為避免 primer dimers 殘留，改以較低之 primer 濃度 100nM 94°C denaturation, 30”；

60°C annealing, 30”；（exon 1 在此步驟為 63°C）

72°C extension, 30”；

總共 30+1 個循環 cycles

上：DNA of M1（male volunteer #1）Exon 1 & 10 with 10% DMSO added 下：DNA of M2（male volunteer #2）without any DMSO（exon 1 在此步驟為

63°C）

顯示 primer dimers 及雜 bands 已消失，若 exon 1 未加 DMSO，則雖無 175bp 之雜 band，但該出現 329bp 的產物則無法順利產生；反而產生大於 1Kbp 的產物。

圖 10 提高 annealing 溫度，以減少雜 bands 及比較 DMSO 加與否的差異

圖11為女性自願者之DNA檢體的PCR產物電泳圖，exon 14的產物很微弱，顯 然60°C並不適合exon 14之反應，應該繼續維持在55°C。

圖 11 女性自願者之 DNA 檢體的 PCR 產物電泳圖

另外如圖12，由於annealing溫度由55°C提高至60°C，為免exon 2-13 PCR的反 應產物產率不佳，MgCl2的濃度需要3mM，比一般1.5mM多一倍。因為exon 1用分 斷放大（先以高一點溫度65°C，9 cycles；再以低一點溫度64°C，反應完剩餘之21 個循環數）擴增的方式，依然無法去除175bp左右長度的雜band。遂決定用切膠的 方式。

圖 12 最後 KAL-1 基因 14 個 exons 的 PCR 反應條件所呈現的電泳圖

為確保exon1之PCR產物的純度，在跑完洋菜膠電泳後，切膠切下分子量長度 329bp的band，再過mini column純化PCR產物的處理。純化用的試劑組採Geneaid 旭基科技的Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit （Cat. No. DF100）

四、 DNA 洋菜膠電泳（Agarose gel electrophoresis）-- PCR 產物的 DNA

品質之確定

由前述PCR amplification所產生的PCR產物DNA，於水平電泳槽，以TBE buffer

（Tris-Borate-EDTA buffer）溶液為電泳電解液，各取少許DNA的PCR產物（約 5~8ul）與5X之loading dye混合均勻，loading在2% agarose gel的well裡。於50~150V，

40~400mA 下 跑 2%agarose gel 電 泳 25~30 分 鐘 ， 然 候 將 整 片 agarose gel 浸 置 於 Ethidium Bromide（簡寫EtBr）中5~15分鐘染色，再用水浸泡或沖洗5分鐘。EtBr

會結合DNA分子，於UV燈照射下於agarose gel產生螢光的帶（band）。若有band 表示DNA分子還完整（intact），若不見band出現，則表示該檢體PCR產物未產生、

DNA量太少、濃度太稀或者已經裂解，品質堪慮。

DNA Ladders Standard

使用Bioman廠牌DM100之100bp的DNA Ladders standard marker，能提供100、

200、300、400、500、600、700、800、900、1k、1.5k、3kbps各個長度的片斷。

將定序結果之序列文字檔，利用NCBI的BLAST( Basic Local Alignment Search Tool)比對工具，比對各研究對象（個案）的DNA個別exon序列與KAL-1基因genomic DNA database的最新版本序列（Ensembl 50: Jul 2008 - currently www.ensembl.org）

在DNA nucleotide序列的異同，試圖找出突變位置；再佐以比對定序波型圖譜，若