個案1、2、3、5、7、8均在KAL-1基因的exon 11（c.1600G>A）與exon 12
（c.1833C>T）發生點突變，其中exon 11的c.1600突變點位置造成胺基酸的改變為 Val534Ile，就是在KAL-1 gene的蛋白質Anosmin-1的肽胜鏈（popypeptide）上的第 534個胺基酸位置（residue）由Valine（Val，纈胺酸）變成Isoleucine（Ile，異白胺 酸）。Valine與Isoleucine均屬非極性疏水性胺基酸，且沒有很大的官能基或官能團 在其支鏈上，導致的蛋白質3D結構上構形的大改變之機率可能不大；另一點位 c.1833則位於exon 12相對應是在Anosmin-1的肽胜鏈（popypeptide）上的第611個胺 基酸位置，但是並未改變原本該位置上之胺基酸，Isoleucine（Ile，異白胺酸）；
乃是屬於silent mutation的synonymous mutation。NCBI、Ensembl等public database 顯示這兩突變點均是屬於蠻常見的多型性（common polymorphism），參見表6。
表 6 KAL-1 cDNA 區段的 SNP 與胺基酸改變資訊（cSNP）（摘錄自 NCBI, KAL-1 cSNP inSNP database）
這兩點經查美國國家衛生研究院（NIH）生物科技資訊中心（NCBI）的公共 資料庫，發現此兩突變變異點，實際上是屬單核甘酸多型性的變異點SNP（Single nucleotide polymorphism）。此兩點即分別為c.1600（rs808119）與c.1833（rs809446）， 見表6。且後者rs809446的C minor allele的allele frequency既使在不同研究團隊與資 料庫中，華人漢族裔的allele frequency高達31.2-34.4 %。然而前者c.1600G>A
（rs808119）目前尚無其allele frequency資料在NCBI或相關的資料庫中。
個案1與個案2是一對雙胞胎兄弟，目前單由病歷資料無法判斷他們是屬於同 卵雙胞亦或是異卵雙胞胎，由於他們均有長「多發性骨性軟骨瘤」（multiple exostosis），會令人往同卵雙胞方面推測，但在聽覺上，有一位是正常、另一位則 自小聽障需輔以助聽器。目前已知「遺傳性多發性骨性軟骨瘤」（hereditary multiple exostosis）的致病基因EXT1、EXT2各位於8q24.11-q24.13與11p12-p11（Schmale, G.
A. et al., 2008），似乎與X-linked的KAL-1較無直接關聯。兄弟兩者KAL-1基因序列 分析結果亦是exon 11（c.1600G>A）與exon 12（c.1833C>T）發生點突變。但已知 這兩突變點屬多型性，因此這二點的突變，可能並不是引致這兩兄弟卡曼氏症的 KAL1才成立。不然其極可能是其他（如FGFR1，KAL-2）基因的突變所造成（Franco,
B. et al., 1991）。目前已知個案3的哥哥也是符合卡曼氏症診斷，但其個人並未同意 加入本研究。
個案5、個案7與個案8也是具有前述exon 11與exon 12兩點突變（c.1600G>A）
（c.1833C>T），即c.1600（rs808119）與c.1833（rs809446）兩SNP。個案5另外在 exon 14還有四個突變點，c.1997A>T（Lys666Met）、c.2003G>A（Arg668His）、
以及在3’端的*19G>T與*21G>A。c.2003G>A（Arg668His）有報告說（Georgopoulos, et al., 1997）其實是屬於在健康的人也會有的多型性（polymorphism）；c.1997A>T
（Lys666Met）目前則尚未找到有報告其與任何臨床表徵直接相關。而這兩點
（coding sequence）上找不到突變點與其直接相關。
個案7的染色體Karyotype報告為46，XY，9q12+，16qh+，long Y，經諮詢與 狀、生殖器發育遲滯（micropenis, little axilary & pubic hair）、嗅覺喪失（Anosmia）
以及聽覺障礙（Auditory (Hearing) impairment）等卡曼氏症的臨床表徵，但整個 KAL-1基因的14個exon之序列卻檢查不出任何異常或突變的地方。顯然可能不是 KAL-1基因上的CDS突變造成他的症狀，亦或者是丟失的exon片段，剛好PCR反應
到Y染色體上的KALP pseudogene上的homologous region，所以，我們會以為找不到 突變點，雖然這樣機率不高，但還是無法完全排除其可能性，除非我們進一步用 FISH或是array-CGH的技術再做進一步確認。
此外，序列分析結果呈現最複雜的，莫過於個案6這位5歲的小朋友，從exon 11
（Intron 10交界處）一直到exon 14共有37個突變點位，很顯然要在一次受精卵的發 育就有這麼多的突變似乎不太能，既使是來自於父母，那父或母早就有症狀，怎 麼能夠讓性腺發育到能孕育下一代（個案），病歷上未特別記載父母是否有因性腺 發育遲滯而接受賀爾蒙治療，所以，推測PCR反應的產物擴增到了Y染色體上的同 源pseudogene KALP上的機率極大。KALP是KAL-1在Y染色體上同源演化的對偶基 因，經過 靈長類演化的過程，變成Y染色體上Yq11.2上不再製造任何蛋白的 pseudogene。除了KALP僅總共有11個exons，無KAL-1的exon 3、exon 8與exon 9，
KALP與KAL-1在序列上具有高度相似性89.7~98.9%（Del Castillo, I., et al. & Incerti, B. et al., 1992）。
另 外 ， 個 案 6 的 病 歷 記 載 個 案 的 染 色 體 檢 查 報 告 Karyotype 為 46, Y, add (X)(p22.3)，即Y染色體正常，而X染色體p22.3位置多嵌上了一段不知來自於何處 的染色體小片段。其母親則是46, XX, add (X)(p22.3)也是有一段染色體小片段嵌入 Xp22.3的位置上，其父為46, XY正常，而其外祖母是46, XX，外祖父是46, XY, long Y。
才會定序結果是如此紊亂，突變位置點位眾多。也有可能嵌入了來自別處基因的 片斷，破壞了原Xp22.3位置KAL-1的完整性，造成我們PCR反應反而擴增到Yq11.2 上的同源pseudogene KALP上了。
但個案KAL-1的exon 10很顯然是整個丟失（deletion），而我們在PCR反應 所得產物，從Intron 10與exon 11交界一直到exon 14所PCR反應擴增到的產物片 段，便已經是突變紊亂的現象。因此，很可能個案6的KAL-1基因從exon 9以後，即 exon10一直到exon 13(或exon 14)就整個大片段丟失，才會造成我們PCR反應擴增不 到Xp22.3上的KAL-1，反而擴增（amplified）到Y染色體上的KALP的同源區段去了。
參見表7，14 exons primer pairs match KALP sequence的情形，顯示利用原本KAL-1 的14 exons的14對primers，真的去比對是否吻合（match）Y染色體的KALP基因區 段時，發現exon 2、exon 5、exon 11、exon 13的reverse strand的primer sequence序列，
還完全吻合到KALP基因區段相對應同源的exon區域；就算是其他未完全吻合的 exon primers，如： exon 6、exon 7、exon 10、exon 11的forward strand，以及exon 12 的reverse strand也僅差1個鹼基；exon 5的forward strand、exon 10的reverse strand以 及exon 12的forward strand，也僅差別2個鹼基。因此，初步判斷，在某些恰好的溫 度、或其他條件符合下，PCR反應可能也無法排除不放大擴增到Yq11.2的KALP基 因之區段。亦或者是這Yq11.2恰好是經重組轉位，嵌入了Xp22.3位置的片段，所以 我們PCR一直擴增到此處的產物。
表 7 KAL-1 的 14 exons primer pairs match KALP sequence 的情 形
Exon Forward (F) or Reverse (R) strand
Similarity of primer in nucleotide within KALP
2 R Perfect match
至於個案6的exon 14定序結果是屬於KAL-1的產物還是Y上的KALP的產物，則 需要進一步釐清，因為單從個案6的突變點眾多，從Intron 10與exon 11交界一直到 exon 14，我們也許乍看會推測應該是個案6從exon 10就丟失一直到exon 14，甚至 因為前述個案5其exon 14也有四個突變點，「c.1997A>T（Lys666Met）、c.2003G>A
（Arg668His）、在3’端的*19G>T與*21G>A」與個案6的exon 14突變情形一樣，進 而 也 推 斷 個 案 5 可 能 也 與 個 案 6 一 樣 擴 增 到 KALP 。 但 前 已 提 到 exon 14 上 的 c.2003G>A（Arg668His）可能是一般的多型性（Georgopoulos, et al., 1997），所以，
也許個案6的exon 14還在，才會擴增到此4點。而且，有趣的是當我們將KAL-1與 KALP在公共資料庫的Genomic sequence最後的exon序列放在一起比對BLAST，發 現兩同源exon高達96%的相似序列，其CDS不同的點位居然就是前述個案5與個案6 的exon 14之四個突變點。不過，縱然如此，我們還是無法就此確認我們PCR擴增 到的個案5與6的exon 14產物，就是來自其KALP的產物。假若是，那為何另外六位 個案在同樣PCR條件，exon 14產物並沒有發現這四個突變點；也許我們可以找exon 14前後（Intron 13與exon 14之3’-UTR）比較特殊unique，能區別KAL-1與KALP基 因的序列，重新設計primer，來重新PCR擴增最後exon產物定序之，說不定可以釐 清。因此，個案5與個案6的exon 14之四個突變點，值得我們進一步去探討與確認。
要證明前段敘述所執「PCR擴增到Yq11.2的KALP基因之區段」的假說，則還 需要許多工作，例如：利用FISH或是array-CGH的技術再去定位個案6的add (X)(p22.3)片段，以及其KAL-1基因的Intron 10與exon 11交界一直到exon 14，是否 還存在，然後再與個案母親以及外祖父一一作比對、定位，才能進一步一一排除，
確定是前述的哪種可能性產生的現象。
此外，也可利用Long range PCR，乾脆將個案6的KAL-1基因整個複製下來，或 是將個案6的KAL-1基因整個cloning下來，再來重新設計primer，re-sequencing，確 認與驗證其KAL-1基因上的區段序列，是否如我們先前的定序結果般地如此紊亂，
突變眾多。但這些都是需要投入更多時間的工程。
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附 錄
表 8 KAL-1 基因 14 個 exons 之 CDS 長度與 mRNA 長度參照表
Gene Exon length (bp ) CDS Nucleotide
position Note length of mRNA
KAL1 5'-UTR 150 150
各exon鹼基長度參考KAL-1 gene genomic DNA database的最新版本序列
各exon鹼基長度參考KAL-1 gene genomic DNA database的最新版本序列