第一節. 健保歸人檔不孕症分析
國家衛生研究院於西元 2000 年隨機抽取 20 萬全民健康保險投保 人，回顧 1996 年至 1999 年門診就醫記錄、住院就醫記錄，也包括就醫、
用藥所需的花費，並持續追蹤至 2003 年。利用此資料庫，探討台灣不孕 症描述性流行病學，包括不孕症男性女性每年個別盛行率。此外，以年 齡別、地區別、人口密度個別分層計算其盛行率，利用邏輯斯回歸進ㄧ 步探討社會人口學變項是否影響不孕症的發生。最後，評估不孕症婦女 經治療懷孕的情況。
研究架構
不孕症健保資料庫分析
健保資料庫
男性不孕症
病因別 年齡別 地區別 都市化程度
女性不孕症
病因別 年齡別 地區別 都市化程度
受孕情況
自然分娩 剖腹產 不正常受孕
不孕症
第二節. 壬基苯酚和男性不孕症 ㄧ、研究設計
橫斷性的研究，以分子流行病學的方法探討壬基苯酚暴露和男性精 液品質的相關特性。
二、研究對象
以中部某婦產科不孕症門診夫婦為主，以不孕症的原因及精液品質 的檢查區分精液品質正常男性及異常男性。
三、研究工具的擬定
在不孕症門診，詢問夫婦願意配合此研究的意願，在獲得同意的情 況下，進行 10 分鐘的問卷訪視，包括人口學資料、生活習慣、抽菸、喝 酒、嚼檳榔、熬夜習慣、飲食習慣資訊的取得，且夫婦能協助配合此研 究尿液檢體的取得，約 15cc；病歷資料訊息的取得，如男性精液品質檢 查的結果，也獲得醫師及受訪不孕症夫婦的同意許可。本研究獲得中國 醫藥大學人體試驗委員會(IRB) 許可。
四、實驗室樣本處理分析 (一) 肌酸酐分析
實驗材料與方法 試藥
1. 肌酸肝 (creatinine, standard solution 10mg/ml, USA)
2. 苦味酸 ( picric acid 0.5%, saturated, Sigma-Aldrich, USA ) 3. 磷酸二氫鉀 ( potassium dihydrogen phosphate, ＪＴ-BAKER,
Phillipsburg, NJ, USA )
4. 硫酸 ( sulfuric acid，98%, Merck, Germany) 5. 氫氧化鈉 ( sodium hydroxide, Merck, Germany ) 器材
1. 分光光度計 (spectrophotometer, UV-160A, Shimadzu, Tokyo, Japan)
2. 震盪槽 ( shaker bath, Firstek Scientific B603 ) 試藥配置
肌酸酐檢量線配置
分別取 10 mg/dl 肌酸酐標準溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0 ml，各加入 去離子水 2.0、1.5、1.0、0.5、0 ml 混合均勻，檢量線濃度範圍為 0、
2.5、5、7.5、10 mg/dl。各取出 0.5 ml，加入 3 ml 去蛋白試劑，靜置 十分鐘。取上清液 2 ml，加入 1 ml 苦味酸及 0.75 N 氫氧化鈉 1 ml，
於 25 0C 的水浴槽靜置 20 分鐘後取出。
尿液前處理
250 μL 尿液，以去離子水稀釋至 10 ml，取出 0.5 ml 稀釋尿液，加入 3 ml 去蛋白試劑，靜置十分鐘。取上清液 2 ml，加入 1 ml 苦味酸及 0.75 N 氫氧化鈉 1 ml，於 25 0C 的水浴槽靜置 20 分鐘後取出。呈色樣 本以分光光度計測定，波長為 520nm。
(二) 壬基苯酚分析 實驗材料與方法 試藥
1 醋酸 (acetic acid, Fluka, USA)
2 醋酸胺 (ammonium acetate, Sigma-Aldrich, USA) 3 氫化甲烷 (acetonitrile, Tedia)
4 鹽酸 (hydrochloric acid 37%, Sigma-Aldrich, USA) 5 甲醇 (methanol, Mallinckrodt-Paris Kentucky, USA)
6 β-glucuronidase/arylsulfatase (5.2 U/ml / 2.1U/ml, Merck, Germany)
7 壬基苯酚 (4-nonylphenol, NP, 85% p-isomers, Fluka, USA) 器材
1. 離心機 ( centrifuge, Hitachi O5P-21, Tokyo, Japan) 2. 超音波震盪槽 ( electronic, Branson 8200, USA )
3. 微量電子天秤 ( micro-scale, ER-182A, Tokyo, Japan ) 4. 酸鹼測定計 ( pH meter 320, Corning, UK )
5. 震盪槽 ( shaker bath, Firstek Scientific B603 )
6. 固相萃取管 ( Varian 500mg/3ml Bond Elut-PH, Palo Alto, USA ) 儀器
1. 樣本自動注入裝置 (autosampler, SIL10A, Shimadu, Japan) 2. 分離管住 (Supelco 5μm C18 150×4.6mm)
3. 保護管住 (Guard column)
4. 螢光偵測器 (fluorescence detector, RF-10Axl, Shimadzu, Japan) 5. 幫浦 (intelligent pump, LC-6A, Shimadzu, Japan)
6. 訊號聯結器 (interface)
7. 層析軟體 (訊華 SIS-LAB 層析積分處理系統 98 版)
（high performance liquid chromatography）進行層析，並串連螢光 偵測器定量壬基苯酚濃度。分析步驟如下：
1. 取 10 mL 尿液樣本置於 20 mL 玻璃瓶中，以醋酸調至 PH ＝ 5.5。
2. 加入 1mL 1M 醋酸銨緩衝液（PH ＝ 5.3）及 125μL β
-glucuronidase/arylsulfatase（0.65 U/0.26 U）後均勻混合。
3. 將尿液樣本置於 37 ℃水浴槽中震盪 15 小時後。
4. 以 37 ％氯化氫將尿液樣本酸化至 PH=3 後備用。
5. 加入 10 mL 甲醇於 Varian PH 固相萃取管清洗管柱，再加入 3 mL 事先經 1M 氯化氫酸化至 PH ＝ 3 的去離子水調理。
6. 將步驟 4 的樣本加入 Varian PH 固相萃取管中。
7. 以 5 mL 去離子水清洗固相萃取管後，加入 3 mL 甲醇沖提待測物
（壬基苯酚）。
8. 將收集之甲醇置於 1.8 vial 瓶中上機。
9. 以系列稀釋配製檢量線所需之一系列標準品濃度 5.84、17.53、
52.59、157.78、473.33g/L 後，分別置於 1.8 vial 瓶中上機。
10. 將前處理完的尿液樣本和一系列標準品注入附有螢光偵測器的 HPLC 分析。自動注入裝置設定注射 20μL 樣本，進入 Supelco 5 μm C18 150×4.6 mm 管柱中進行分離，移動相為氰化甲烷和去離 子水，比例為 70：30，流速為 1.0 mL/min。
11. 利用螢光偵測器測定樣本中壬基苯酚：設定激發波長 280 nm，發 射波長 305 nm。
12. 將一系列標準品分析結果和濃度作圖建立檢量線後，將尿液樣本 分析結果代入線性回歸方程式，可回推尿液樣本中壬基苯酚濃度。
所有尿液樣本分析後所得之壬基苯酚濃度均需經尿中肌酸酐校正後呈 現。
(三) 精液分析
活動性：
取一滴精液置於玻片上蓋上蓋玻片，以 400 倍顯微鏡觀察，計算 100 隻 精蟲不論死活，算出活動精蟲的比率。只要有活動的精蟲就算具有活動 性 (Mobility)。
精蟲型態：
將精液混合均勻，取一滴於乾淨玻片上，將之推成薄片，空氣乾燥後直 接染色，利用染色的薄片以區別正常與不正常精蟲型態(Morphology)。
染色方法以 Papanicolaou stain、Liu’s stain、Giemsa stain、
Diff-Quick stain 等皆可。如果精蟲濃度低於每 cc ㄧ千萬時，必須將 精液以 2000 rpm 離心 15-20 分鐘，在取沉澱物作成 smear。
精液分析的部分由婦產科實驗室協助分析。
WHO 定義正常精液品質：
1. 精蟲數目＞20×106 1/ml 2. 精子活動度＞50 ％
3. 正常精蟲型態比例＞20 ％
(四) 尿液中 8-OHdG 分析
本研究參考 Yin74 等發表之酵素連結免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，使用美國
OXIS
researchTM公司生產的 測量 8-OHdG 之 commercial ELISA kit，其原理是利用競爭型 ELISA 來偵 測 8-OHdG。其分析步驟如下：（1）分別加入 50 μl 尿液樣本或 8-OHdG 標準品於 commercial ELISA kit 上的不同 well，無使用之 well 加入 50 μl 二次去離子水以保持相 同溫度。
（2）於所有 well 加入 50 μl primary Ab (monoclonal Ab specific for 8-OHdG)，置於 37 ℃培養 1 小時。
（3）以 250 μl PBS 清洗 3 次。
(4) 加入 100 μl secondary Ab (HRP (horseradish
peroxidase)-conjugated Ab)，置於 37 ℃培養 1 小時。
（5）以 250 μl PBS 清洗 3 次。
（6）加入 100 μl 呈色劑(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)，避光，
置於室溫下 15 分鐘。
（7）此時會出現淡藍色，加入 100 μl 中止劑(1M phosphoric acid)後 變為黃色，反應 3 分鐘。
（8）測 450 nm 吸光率（absorbance），5 分鐘內判讀完畢。
（9）取 8-OHdG 標準品 0.5、2、8、20、80、200 ng/ml 濃度之 log 值與 吸光率作圖，再以樣本之吸光率換算出濃度。
（10）所有 8-OHdG 濃度均以樣本本身之肌酸酐濃度校正後呈現（µg/g creatinine）。
(五) 資料統計與分析
可能影響此研究相關變項皆納入探討，人口學資料包括年齡、BMI、
工作壓力、生活壓力、工作場合是否接觸有害物質；生活習慣包括是否 長期服用保健營養品或藥物，每週穿緊身褲的頻率、浸泡熱水澡的頻率、
劇烈運動的習慣；飲食習慣著重於牛肉、豬肉、雞鴨鵝肉、羊肉、全脂 奶、脫脂奶、魚肉、海鮮類食物，內臟類食物、蛋、水果、咖啡、茶、
生菜沙拉每月或每週攝取的頻率。資料建檔以 Microsoft Office XP Excel 2003 為主。統計分析軟體使用 SAS 8.2 版。
統計分析使用無母數分析方法，先探討各變項頻率的分布是否造成 男性壬基苯酚內在暴露量及 8-OHdG 的差異性，或者對精液品質有影響，
兩個變項比較使用 Wilcoxon rank sum test，三個變項或以上使用 Kruskal-wallis test；以皮爾森相關係數(pearson correlation)探討 男性壬基苯酚內在暴露量與年齡別、BMI、8-OHdG、精子數目、精子活動 力、精子正常形態比例之間的相關性；依據精液品質正常與否，分別將 精子數目、精子活動力、精子正常形態比例區分為正常者與不正常者，
比較男性壬基苯酚內在暴露量及 8-OHdG 的差異；最後將壬基苯酚依內在 暴露量分層，以邏輯式回歸探討精液品質與壬基苯酚內在暴露量危險 比，且觀察是否有劑量效應關係。
資料分析架構
壬基苯酚、8-OHdG 與男性精液品質相關性探討
人口基本資料和生活型態
性別、年齡、身體質量指數、教 育程度、工作內容、抽菸、喝酒、
工作環境、生活習慣、穿著習 慣、用藥習慣、工作壓力和家庭 負擔等
壬基苯酚內在暴露量及
8-OHdG氧化損害能力
尿液中壬基苯酚濃度、8-OHdG
男性精液品質
精子數量 精子活動度
精子正常形態比例