第二章 實驗材料及方法
第二節 研究方法
(1) 維生素 A 酸 (all-trans Retinoic acid)
於避光的環境下，先配製 10-2 M 儲存液(stock solution)，其方 法如下:取 3 mg 的維生素 A 酸溶於 1 ml DMSO 中，混合均勻至完全溶 解。以每 20μl 分裝至 1.5 ml 褐色微量離心管，儲存於-80℃，保存 期限為兩至四週。使用時，再稀釋 1000 倍於培養液中，最終濃度是 10-5 M。
(2) PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)
於避光的環境下，先配製 10-4 M 儲存液 (stock solution)，其 方法如下:取 5 mg 的 PMA 溶於 1 ml DMSO 中，混合均勻至完全溶解，
濃度為 0.8 mM。再取 10 μl PMA 稀釋 8 倍於 DMSO。接著，再稀釋 10 倍於 DMSO。以每 20 μl 分裝至 1.5 ml 褐色微量離心管，儲存於 -20℃。使用時，再稀釋 1000 倍於培養液中，最終濃度是 10-7 M。
(3) 維生素 C (L-Ascorbic acid)
維生素 C 對熱與光敏感，且於酸性 pH 較為穩定，所以必須在實 驗時現配。於避光的環境下，進行實驗時將維生素 C 溶於 PBS，配製 成 200 mM，再以培養液稀釋成實驗所需濃度。
(4) 維生素 E (α-Tocopherol)
於避光的環境下，將維生素 E 溶於 DMSO，配製成 200 mM，再以 培養液稀釋成實驗所需濃度。DMSO 的比例不超過 0.1%。
(二) 細胞培養 (Cell culture)
(1) SH-SY5Y 細胞之培養、繼代及分化
將SH-SY5Y 細胞種在10公分塑膠培養皿中，培養在RPMI 1640培 養基中 (含有10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 100 μg/ml streptomycin, 100 units/ml penicilin)，置於37℃、
5% CO2條件之盤養箱培養。每隔1天更換一次培養液，每4天分盤一次。
分盤前先將培養皿內的培養基移除，以2 ml之1× PBS清洗兩次，再加 入 2 ml的PBS 至培養皿內後，置入培養箱中。5分鐘後緩慢搖晃並且 輕輕拍打培養皿，使附著於培養皿的細胞脫落。將細胞轉移至15 ml 的離心管，離心700 rpm，1分鐘，去除上清液。加入新鮮的RPMI 1640 培養液2 ml，並且以微量吸管輕輕吸放打散細胞並且將細胞混合均 勻，取20μl的細胞液至細胞計數盤計數。之後將細胞分至二個10 cm 培養皿，放置於培養箱中，維持在37℃、95﹪的空氣、5% 二氧化碳 條件下培養。本實驗使用之已分化的SH-SY5Y細胞，步驟如下:未分化 的SH-SY5Y細胞於分盤隔天，將培養液移除，以2 ml PBS清洗兩次，
再加入含10-5 M維生素A酸之培養液中培養，每天更換含有維生素A酸 的培養液至第3天，誘發SH-SY5Y細胞分化為神經細胞。
(2) THP-1 細胞之培養、繼代及分化
將 THP-1 細胞培養於 10 公分塑膠培養皿中，給予含有 10% 胎牛 血清的 RPMI 1640 培養液 10 ml。每隔 1 天更換一次培養液，每 4 天 分盤一次。分盤前先將培養皿中含有細胞的培養液轉移至 15 ml 的離 心管，離心 1000 rpm，5 分鐘，去除上清液。加入新鮮的 RPMI 1640 培養液 2 ml，再以微量吸管輕輕吸放打散細胞且將細胞混合均勻，
取 20 μl 的細胞液至細胞計數盤計數。之後將細胞分至二個 10 cm 培養皿，放置於培養箱中，維持在 37℃、95﹪的空氣、5%二氧化碳 條件下培養。本實驗使用之已分化的 THP-1 細胞，步驟如下:未活化 的 THP-1 細胞加入 10-7 M PMA 培養 4 天，誘發 THP-1 分化成類似微小 膠細胞。
(3) 細胞計數
將已打散並且混合均勻的細胞，以微量吸管取 20 μl 的細胞液，
藉由毛細現象將細胞液吸入細胞計數盤計算室中，於相位差倒立顯微 鏡下觀察，先用低倍顯微鏡 (100×) 找到計算室四角之四大方格後，
計算細胞計數盤四大格內的所有細胞數。
細胞數之計算公式:
細胞數/ml = 計數所得的細胞數 × 1/4 × 104 cells/ml。
(三) 細胞存活率分析 (Cell viability assay)
(1) MPP+處理分別對 SH-SY5Y 細胞和 THP-1 細胞的存活率影響 將 SH-SY5Y 細胞種 8×104 cells/well 至 96 孔塑膠培養盤中，將 SH-SY5Y 細胞分為分化組及未分化組。分化組之 SH-SY5Y 細胞須預先 加入 10-5 M 的維生素 A 酸培養 3 天，誘導 SH-SY5Y 細胞進行分化。另 外，THP-1 細胞種 8×104 cells/well 至 96 孔塑膠培養盤中，加入 10-7 M PMA 培養 4 天，誘導 THP-1 細胞分化。加藥 MPP+處理細胞前，
先將培養液移除，以 1× PBS 清洗細胞一次。SH-SY5Y 細胞或 THP-1 細胞分別皆給予不同濃度的 MPP+ (0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、
5.0 mM) 處理 24 小時。此時 96 孔培養盤之每個小格液體容積為 100 μl，置入培養箱培養 24 小時後，先於相位差倒立顯微鏡下觀察細胞 型態。於避光環境下，每個小格再加入 100μl MTT 溶液 (0.5 mg/ml) ，置入培養箱中培養 4 小時。MTT 溶液經由存活細胞之粒線 體中的琥珀酸脫氫酶 (dehydrogenase) 作用後會形成紫色的沉澱 MTT-formazan。每個小格加入 100 μl 的 10% SDS 作用至隔天，SDS 將紫色結晶溶解呈均質溶液，經 ELISA reader 570 nm 的波長檢測，
可以得其吸光值。在 Excel 程式裡將吸光值換算細胞存活率 (%)。
細胞存活率之計算公式:
細胞存活率 (%) = 實驗組之吸光值 ÷ 對照組之吸光值 × 100%
(2) MPP+對已分化 THP-1 與已分化 SH-SY5Y 細胞共同培養 (co-culture) 之毒性測試
將 THP-1 細胞種 2×105 cells 至每個 18×18 mm 蓋玻片上，並且 加入 10-7 M PMA，培養 4 天，誘導分化成類微小膠細胞。在分種細胞 前，先將玻片四個角滴上牙科蠟 (wax) 當作玻片的角架 (圖 D)。牙 科蠟的高度約 1 mm，在紫外光下消毒 20 分鐘後再使用。另外，將 SH-SY5Y 細胞種 4×105 cells/well 至 6 孔塑膠培養皿中，隔天加入 10-5 M 維生素 A 酸培養 3 天，使 SH-SY5Y 細胞分化為神經細胞。加藥 MPP+處理細胞前，先分別將兩株細胞之培養液移除，以 1× PBS 清洗 細胞一次。分別給予不同濃度 MPP+ (0、0.5、1.0 mM)或不同時間點 (24、48、72 小時) 至共同培養模式的 SH-SY5Y 細胞中，此時每個小 格的液體體積為 2 ml。再將已分化 THP-1 細胞之玻片架至已分化完 成的 SH-SY5Y 細胞上，兩株細胞下共同培養於 MPP+處理中。分別經過 24 小時、48 小時、72 小時共同培養後，於相位差倒立顯微鏡下觀察 細胞型態。再加入 MTT 溶液 (0.5 mg/ml)，測試 SH-SY5Y 細胞存活率。
(四) 免疫螢光染色法 (Immunocytochemistry)
將 SH-SY5Y 細胞與 THP-1 細胞種 2×105 cells/well 至 6 孔培養 皿中。SH-SY5Y 細胞給予 10-5 M 維他命 A 酸處理 3 天，使其分化為神 經細胞。THP-1 細胞給予 10-7 M PMA 處理 4 天，使其分化為類微小膠
細胞。將細胞放置培養箱中培養。進行免疫螢光染色前，先將培養液 移除，以 1× PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。於室溫下進行以下步 驟：以 3.7% Formaldehyde 固定細胞 15 分鐘，再以 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。接著加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 進行細胞膜 打洞 20 分鐘，過程中輕輕的搖晃。再以 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。加入 blocking buffer (含 1% normal goat serum, 1% BSA 及 0.1% Triton X-100, 1× PBS)，20 分鐘，封鎖非特異性訊息。之 後加入一級抗體 (抗體稀釋液含 1% normal goat serum, 1% BSA, 0.1% Triton X-100, 1× PBS) 處理 2 小時。再以 PBS 清洗細胞 3 次，
每次 5 分鐘。接著加入螢光接合的二級抗體 (抗體稀釋液含 1%
normal goat serum, 1% BSA, 0.1% Triton X-100, 1× PBS)，並且 避光反應 2 小時。再以 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。於螢光顯微 鏡下觀察。CD11b-PE 抗體步驟略有不同，不需 3.7% Formaldehyde 固定細胞。
(五) DAPI staining (4´,6-Dianidino-2-phenylindole)
MPP+處理之細胞，去除培養液後，以 1× PBS 清洗 3 次，每次 5 分鐘。以 3.7% Formaldehyde 固定細胞 15 分鐘，再用 PBS 清洗細胞 3 次，每次 5 分鐘。接著加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 進行細胞 膜打洞，20 分鐘後，再予 DAPI 染色。實驗前，先將 DAPI 稀釋於二
次蒸餾水，濃度為 1 mg/ml，儲存於-20℃。進行染色前，將 DAPI 儲 存液稀釋 1000 倍，濃度為 1 μg/ml，再加入細胞中作用 20 分鐘，
於螢光顯微鏡下觀察。
(六) 西方轉漬法 (Western blot) (1) 蛋白質收取 (Protein extract)
細胞加藥處理 24 小時後，全程置於冰上進行蛋白質收取。收集 其培養液至 15 ml 離心管中，再以 1× PBS 清洗培養皿裡的細胞，接 著加入 1 ml trypsin 作用 5 分鐘，使細胞脫離培養皿。將細胞液收 集至 15 ml 離心管，離心 2700 rpm，5 分鐘。移除上清液，將沉澱的 細胞置於 -80℃冰箱至隔天。取出細胞樣品回溫後，加入 lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF，0.25% sodium deoxycholate, 1 mM EDTA，1 mM Na3VO4, cocktail protease inhibitors)，每個樣品以超音波震盪 4 次，每次 15 秒。
接著，予高速離心 14000 rpm，30 分鐘。以 Bradford 分析法將蛋白 質定量後，用 PB (phosphate buffer) 將每個樣品的蛋白質濃度調 成一致。
(2) SDS 聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 配製 0.75 mm 的不連續膠體電泳 (discontinuous-PAGE)，上層
stacking gel 是 5%濃度的膠片，下層 separating gel 是 10%濃度的 膠片。膠片架至電泳槽中，將 running buffer (1× TG-SDS buffer) 倒入電泳槽內。蛋白質樣品加入 protein loading dye (4× loading dye 內含 250 mM pH 6.8 Tris-HCl, 8% SDS, 0.2% Bromophenol blue, 30% Glycerol, 500 mM DTT)，放置於 95℃乾浴槽加熱變性 10 分鐘，
快速離心後，將樣品混合均勻，每個樣品取 20 μg 注入樣本槽中。
樣品於上層膠電泳時，予電壓 70 voltage，樣品於下層膠電泳分離 時，電壓調成 100 voltage。
(3) 蛋白質轉印法
將 PVDF 膜先浸泡於 100% Methanol 10 到 15 分鐘。再與 3M 濾紙、
海綿一起浸泡於 transfer buffer (1× TG buffer 含 20% Methanol)10 分鐘。去除電泳膠之上層膠後，膠片浸泡在 transfer buffer 中。使 用半乾式轉印器，在石墨板先舖上 3 張溼濾紙，小心疊上已潤溼的轉 印紙，再小心平舖膠片上去，加蓋 3 層濾紙。將半乾式轉印器正極蓋 上。接上電源開始轉印 (電流=PVDF 膜面積×片數×1.2)，轉印 1.5 小 時後中止轉印。PVDF 膜加入 blocking buffer (5% non-fat milk, 1×
PBS, 0.05% Tween-20) 於室溫下搖晃 1 個小時，可阻隔非特異性蛋 白質的干擾。以 PBST (1× PBS, 0.05% Tween-20) 清洗 PVDF 膜 3 次，
每次 10 分鐘。把轉印紙放在一級抗體溶液中反應，置 4℃反應至隔
天。以 PBST (1× PBS, 0.05% Tween-20) 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 10 分鐘。加入 HRP-conjugated anti mouse 或 anti rabbit 的二級抗 體，置室溫反應 1 小時。以 PBS 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 5 分鐘。於 暗房以 ECL kit (Enhanced Chemiluminescence kit) 進行酵素呈色 反應。PVDF 膜置於壓片夾中，以 X-ray 底片感光顯像。
(七) 統計分析
本實驗所得之數據以 Mean (平均值) 呈現，並利用SPSS統計軟 體之單因子變異數分析 (One-way ANOVA) 之Tukey :compare all pairs of columns的多重比較檢定，分析各組處理組間之差異。
當