近年來，越來越多的文獻探討神經膠細胞在帕金森氏症的致病機 轉 上 的 影 響 。 有 文 獻 指 出 膠 細 胞 - 神 經 的 互 動 (glia-neuron interaction) 有顯著增加神經保護的訊息 [81]。然而，也有文獻指出 共同培養之活化的微小膠細胞會加劇神經毒性複合物的神經毒性
[29]。因此，本研究主要探討微小膠細胞在帕金森氏症的神經細胞退化 過程中所扮演的角色，並探討抗氧化劑是否可以減低神經細胞的傷 害。以 MPP+直接作用在單獨培養的神經細胞以及 MPP+作用在微小膠細 胞-神經細胞共同培養之兩種模式，對神經細胞造成的影響。
目前在體外實驗 (
in vitro
)有許多研究膠細胞-神經的互動 的方法。因為條件些微的不同，造成實驗結果很大的差異。本論文以 人類神經瘤母細胞株 SH-SY5Y 細胞，作為神經細胞模式。而人類單核 球細胞株 THP-1 細胞，作為類微小膠細胞模式。本論文實驗設計以 SH-SY5Y 細胞經 10-5 M 濃度的維生素 A 酸誘導成分化的 SH-SY5Y 細 胞，成為有絲分裂後細胞類神經細胞 (post-mitotic neuron-like cells)，並且可以表達神經細胞特性[52]，而 THP-1 細胞經 10-7 M 濃度 的 PMA 誘導可分化成的類微小膠細胞/巨噬細胞[67]。將上述兩種細胞 共同培養。此共同細胞培養的模式已廣泛用於探討神經退化性疾病與微小膠細胞之間作用的研究[41-43, 80]
，如β-amyloid、rotenone 、LPS 之研究。而本實驗是首次此共同培養模式作為 MPP+神經毒之研究。並 且本實驗是使用 SH-SY5Y 與 THP-1 細胞共同培養，雖然細胞間無直接 接觸 (direct cell contact)，但細胞之間可經由分泌的可溶性因子 (soluble factors) 而影響對方。目前因技術上的困難而未使用直接 互動 (direct cell contact) 的共同培養模式。預期若使用直接互 動的共同培養模式，因有細胞之間直接接觸的效果，可能會帶來不同 的實驗結果。本實驗未使用 THP-1 細胞條件培養基 (conditioned medium)處理 SH-SY5Y 細胞，因為有報告指出條件培養基模式在β -amyloid 研究中，可能因 THP-1 細胞釋放之物質屬於短效作用，導 致轉移培養液在轉換過程中神經毒性消失。
本研究主要探討微小膠細胞對 MPP+引起的神經毒性之影響。首 先，測試 MPP+對未分化及已分化 SH-SY5Y 細胞的毒性，結果發現已分 化 的 SH-SY5Y 細 胞 敏 感 度 較 低 ， 且 MPP+ 的 細 胞 毒 性 是 dose-dependent。進一步探討，phospho-p38 在 MPP+處理未分化及已 分化的 SH-SY5Y 細胞毒性之角色，實驗結果發現 MPP+造成的細胞毒性 可能經由 phospho-p38 增加的途徑。而 MPP+濃度 1.0 mM 處理已分化 的 SH-SY5Y 細胞因 phospho-p38 表現量降低，所以細胞死亡率較同樣 MPP+濃度 1.0 mM 處理於未分化 SH-SY5Y 細胞來得低。 MPP+濃度 3.0
mM 處理已分化的 SH-SY5Y 細胞的細胞死亡率增加是因為 phospho-p38 表現量增加，這個結果與圖六 MPP+濃度 3.0 mM 才會造成已分化 SH-SY5Y 細胞顯著死亡相符。MPP+造成的細胞毒性可能是藉由增加 p38 的表現量。這與之前有研究指出藥物 Minocycline 能減低 MPP+毒性 是藉由抑制 p38 的活化的報導相符[25]。再者，我們的實驗結果顯示，
維生素 A 酸處理組中，在 MPP+濃度為 0、1.0 mM 時，phospho-p38 的 表現量較低，這也與之前文獻報導維生素 A 酸能抑制 p38 磷酸化的表 現相符[57]。所以我們推測已分化的 SH-SY5Y 細胞對 MPP+的毒性較不敏 感是因為 p38 的磷酸化被維生素 A 酸抑制之緣故。
過去文獻指出帕金森氏症與氧化壓力有關[76]，MPP+抑制粒線體複 合體Ι能造成 ATP 下降及 ROS 上升。所以，本論文採用抗氧化劑測試 是否能有保護神經的效果，並且探討氧化壓力是否為造成神經細胞死 亡的主要因素。MTT assay 結果顯示維生素 C 及 E (50、100 μM) 分 別與 MPP+共同處理 24 小時，在未分化及有分化 SH-SY5Y 細胞存活率 雖略為上升，但是統計上並無顯著降低 MPP+引起的細胞毒性。所以在 此模式，維生素 C、E 可能並不是保護神經有效的藥物。因此我們推 測 MPP+引起細胞死亡的主要因素不是因為反應性氧族 (reactive oxygen species,ROS)，這與過去報導 ROS 亦不是引起 PC12 細胞毒性 之主要原因相符[56]。而有趣的是有文獻報導各種抗氧化維生素是否可
降低帕金森氏症的危害率 (rate of PD risk)，其結果顯示任何人工 合成的抗氧化維生素製劑，皆無法有效改善帕金森氏症的危害率，但 若從飲食中攝取高量的維生素 E，則可顯著降低帕金森氏症的危害率
[79]。
由 MTT assay 觀察，MPP+濃度 0.5 及 1.0 mM 處理 24 小時的單獨 培養的已分化 SH-SY5Y 細胞，沒有顯著的細胞死亡。而 THP-1 共同培 養的已分化 SH-SY5Y 細胞在 MPP+濃度1.0 mM 處理 24 小時，則有顯著 的細胞死亡率。表示，微小膠細胞在神經退化上可能佔有重要的影 響。神經軸的回縮 (neurite retraction) 是神經損傷或凋亡的早期 現象[23]。本論文亦嘗試觀察在 MPP+處理共同培養的 SH-SY5Y 細胞是否 有神經軸回縮增加的現象，但因細胞聚集神經軸交錯，我們無法有效 定量神經軸的回縮。微小膠細胞與神經細胞互動的詳細機制，目前仍 不清楚。有文獻指出活化的微小膠會釋放出發炎物質及 ROS 造成神經
毒性[9, 31]。所以，我們使用抗氧化維生素 C (50、100 μM)、維生素
E (50、100 μM) 分別與 MPP+共同處理 24 小時，在共同培養的 SH-SY5Y 細胞存活率雖略為增加，但因為統計標準差太大使統計結果無差異。
因此維生素 C、E 在本實驗共同培養的模式中神經保護效果並不是很 顯著。而在本模式中觀察到略為上升的存活率，有可能是藉由清除 ROS。同時，有文獻指出維生素 E 有抑制微小膠細胞的活化的功能[3]。
因此，實驗中維生素 E 略增加細胞存活率的現象 (圖十三) 可能是藉 由抑制微小膠細胞的活化，減少發炎物質、ROS 等因素而來。而在時 間點 48、72 小時 MPP+處理，在單獨培養的與共同培養的 SH-SY5Y 細 胞之間死亡率無顯著差異。可能的解釋是神經-膠細胞互動的毒性因 子的釋放是在 THP-1 細胞被活化的初期。所以在 24 小時之後，THP-1 細胞釋放的毒性物質就會減少。有報告指出 TNF-α 的分泌是在微小 膠細胞活化的 6 小時之間最為有效[8]。因此，我們推測被活化微小膠 作用在神經細胞的是短期效應。
總結，我們推論 MPP+引起神經毒性，主要並不是經由 ROS 造成神 經細胞死亡，與過去文獻相符[56]。在有微小膠細胞共同培養神經細胞 的情況下，微小膠細胞加劇 MPP+的神經毒性可能是藉由釋放各種的因 子，如 ROS 是其中之一。而微小膠細胞對神經細胞造成的傷害為短期 效應。
MPTP
Gial cell
MPTP
MPTP MAO-BMPP+
DAT
MPP+ Mitochondrion
Vesicular monoamine
transporter
Synaptic vesicle Blood Blood brain barrier
圖 A、帕金森氏症之 MPTP 模型[75]。
圖 B、活化的微小膠細胞可能會分泌的各種因子[9]。
effect factors
Pro-inflammatory IL-1α/β, IL-6, IL-18, IP-10, TNFα
T cell chemotaxis IL-16
Chemotaxis MCP-1, IL-8, MDC, MIP-1 α, MIP-1 β, MIP-2, MIP-3 β,β-Chemokine, Gro-α Proliferation IL-3 T-cell regulation/proliferation IL-15
Proliferation M-CSF Growth factor/proliferation IL-2
Proliferation/T-cell differentiation IL-12 Pro-inflammatory, proliferation PGE2
Anti-inflammatory TGF β
Immunosuppressive IL-13, IL-10
Neurotrophic NGF, BDNF, NT-3, NT-4
Neurotoxic NO, O2.− ,H2O2, OH−, NOO−
圖 C、活化的微小膠細胞調控神經損傷之機制[9]。 Microglia
Activation Neurotoxic trigger
(MPP+, Rotenone ) Immunological Trigger
(LPS, Rotenone)
Neuron Damage/Death
Microglial Activators
(Soluble factors, modification to the ECM) Neurotoxic Inflammatory factors
(IL-1, TNFα, NO, NOO-, O2-, H2O2)
Reactive Microgliosis
圖 D、共同培養模式 (co-culture system)。
Wax Feet THP-1 SH-SY5Y
CoCo--ccuullttuurre e sysysstteemm
MPP+ Antioxidants
PMA RA
SH-SY5Y THP-1
圖一、以相位差顯微鏡 (phase-contrast microscope)觀察 SH-SY5Y 細胞於分化前及分化後之型態變化。
SH-SY5Y 細胞培養後，分別給予以下處理:圖 (A)與 (B)均為未加入 維生素 A 酸分化的 SH-SY5Y 細胞，分別在 200 倍和 300 倍的視野下以 相位差顯微鏡觀察細胞形態。圖 (C)與 (D)均為加入 10-5 M 維生素 A 酸培養 3 天分化後的 SH-SY5Y 細胞，分別在 200 倍和 300 倍的視野下 以相位差顯微鏡觀察分化後的細胞形態。箭號所指處為延伸的神經 軸。(Scale bar= 50 μm)
A
B
C
D
Ctrl
Ctrl RA
RA 200×
300×
圖二、以免疫螢光染色法比較未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞之神經 標記 (neuronal marker)表現。
SH-SY5Y 細胞培養後，加入 10-5 M 維生素 A 培養 3 天，使之分化。(A) 與(E)係未分化的 SH-SY5Y 細胞，(C)與(H)係分化後的 SH-SY5Y 細胞。
以免疫螢光染色法，偵測未分化(B)及已分化(D) SH-SY5Y 細胞之 NF-H (neurofilament heavy chain)表現量之差異。此外，以免疫螢光染 色 法 ， 偵 測 未 分 化 (F) 及 已 分 化 (I) SH-SY5Y 細 胞 之 MAP2 (microtubule associated protein 2) 表現量之差異。所有圖係以 300 倍視野的相位差螢光顯微鏡觀察並照像。(G)與(J)分別為(F)與 (I)的 DAPI 對照染色。實驗顯示，已分化的比未分化的 SH-SY5Y 細胞 的 NF-H 表現量較高。而未分化與已分化的 SH-SY5Y 的 MAP2 表現量，
在此無法看出是否有明顯差異。 (Scale bar= 50 μm)
Ctrl Ctrl RA RA
NF-H NF-H MAP2 MAP2
DAPI
DAPI B
DAPI D F I
A C E H
G J
Ctrl RA Ctrl RA
Ctrl RA
圖三、以西方轉漬法比較未分化與已分化的 SH-SY5Y 細胞之神經標記 的 (neuronal marker)表現。
上圖係加入 10-5 M 維生素 A 酸培養 3 天的 SH-SY5Y 細胞，收取蛋白質，
以西方轉漬法偵測 NF-M (neurofilament media chain) 與 MAP2c (microtubule associated protein 2c) 的表現量。已分化的 SH-SY5Y 細胞比未分化的 SH-SY5Y 細胞，明顯表現較多的 NF-M 和 MAP2c 蛋白 質。並且以 β-actin 的表現量當作內標 (internal control)。
160 kD NF-M
β-actin 70 kD MAP-2c
C RA
圖四、以相位差顯微鏡 (phase-contrast microscope)觀察 THP-1 細胞於分化前及分化後之型態變化。
THP-1 細胞培養後，分別給予以下處理:(A)與(B)係未加入 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) 分化的 THP-1 細胞，分別在 200 倍和 300 倍的視野下以相位差顯微鏡觀察細胞形態。圖(C)與(D) 均為加入 10-7 M PMA 培養 4 天分化後的 THP-1 細胞，分別在 200 倍和 300 倍的視野下以相位差顯微鏡觀察分化後的細胞形態。誘發分化 後，大部分的 THP-1 細胞皆由懸浮狀態轉為貼附，且細胞本體增大、
伸出突觸。箭號為分化後貼平的 THP-1 細胞。(Scale bar= 50 μm) B
C
D A
Ctrl
Ctrl
PMA
PMA 200×
300×
圖五、以免疫螢光染色法比較未分化及已分化的 THP-1 細胞之微小膠 細胞表面接受器之標記表現。
THP-1 細胞培養後，加入 10-7 M PMA 培養 4 天，使之分化。圖(A)係未 分化的 THP-1 細胞，(C)係分化後的 THP-1 細胞。以 300 倍視野的相 位差顯微鏡觀察並照像。以免疫螢光染色法，偵測未分化(B)及已分 化(D) THP-1 細胞之 CD11b 表現量之差異。以螢光顯微鏡觀察並照 相。誘發 THP-1 分化後的 CD11b 表現量顯著增加。箭號為有表現 CD11b 抗原的 THP-1 細胞。(Scale bar= 50 μm)
A C
B D Ctrl
Ctrl CD11b
PMA
PMA CD11b
未分化的S H - S Y5 Y
已分化的T HP -1
0
0
圖十、以 DAPI 染色，觀察抗氧化劑對 MPP+處理之未分化 SH-SY5Y 細 胞之細胞核型態變化。未分化的 SH-SY5Y 細胞予以下藥物處理: 0.5
圖十、以 DAPI 染色，觀察抗氧化劑對 MPP+處理之未分化 SH-SY5Y 細 胞之細胞核型態變化。未分化的 SH-SY5Y 細胞予以下藥物處理: 0.5