一 、 觀 察 SH-SY5Y 細 胞 於 分 化 前 及 分 化 後 之 型 態 特 徵 改 變 (Characterizing undifferentiated and differentiated SH-SY5Y cells)
有許多研究指出，MPP+可作為有效誘發多巴胺類神經之傷害，常 被使用於帕金森氏症神經毒性有關的細胞研究[70, 75]。過去研究結果顯 示 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium ion)的神經毒性與劑量和時 間增加成正相關。
本實驗利用 SH-SY5Y 作為神經細胞模式。首先，確認 SH-SY5Y 細胞的特性。SH-SY5Y 細胞用含有 10-5 M 維生素 A 酸的 RPMI 1640 培 養 基 培 養 3 天 ， 使 SH-SY5Y 細 胞 分 化 。 在 相 位 差 顯 微 鏡 (pahse-contrast microscope)下觀察 (圖一 A 與 B)，可以顯著看到 SH-SY5Y 細胞由未分化時圓形的細胞體 (cell body) 轉變成分化後 狹長的細胞體，並且由短的突起延伸出軸 (processes) (圖一 C 與 D)。接著以免疫螢光染色法確定維生素 A 酸誘導 SH-SY5Y 細胞分化可 以 表 達 神 經 分 化 之 標 誌 (neuronal specific differentiation markers): 神經纖維重鏈 (neurofilament heavy chain, NF-H)、微 小管相關蛋白 (microtubule associated protein 2, MAP2)(圖二)。
在螢光顯微鏡下觀察，NF-H 主要表現分佈於神經軸和細胞核周圍 (perinucleus)，已分化的 SH-SY5Y 細胞的 NF-H 螢光表現量較未分化 的細胞強 (圖二 B、D)。MAP2 主要表現分佈於細胞質及伸展的樹突 (dendrite)，本實驗以免疫螢光染色偵測 MAP2 於未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞的螢光強度，在螢光顯微鏡下觀察無明顯差異 (圖二 F、I)。另外，以 DAPI 染色 (圖二 G、J)作為對照染色 (counter stain)。並且，本實驗進一步以西方轉漬法偵測已分化的 SH-SY5Y 細胞之神經纖維絲-中鏈 (neurofilament medium chain, NF-M)和微 小管相關蛋白 2c (microtubule associated protein 2c, MAP2c) 的 表現量。結果顯示，已分化的 SH-SY5Y 細胞表現較多量的 NF-M，分 子量為 160 kD。上述的結果與 2000 年 Encinas 等人所發表的文獻相 符[28]已分化的 SH-SY5Y 細胞的 MAP2c 的蛋白質表現量顯著高於未分化 的 SH-SY5Y 細胞 (圖三)[21, 46]。確認 SH-SY5Y 經由 10-5 M 維生素 A 酸 處理 3 天，可以誘發 SH-SY5Ｙ分化成神經細胞。
二、觀察 THP-1 細胞於分化前及分化後之型態變化
(Characterizing undifferentiated and differentiated THP-1 cells)
本實驗利用 THP-1 作為類微小膠細胞模式。為了確定 THP-1 細胞 的特性，THP-1 細胞用含 10-7 M PMA 的 RPMI 1640 培養基予培養 4 天，
促使 THP-1 細胞分化，並且以倒立相位差顯微鏡觀察細胞型態改變。
未經誘導分化的 THP-1 細胞外型呈小且圓 (圖四 A 與 B)。加入 10-7 M PMA 培養 4 天後，大部分的 THP-1 細胞皆由懸浮狀態轉為附著於培養 盤上，且細胞本體增大 (圖四 C 與 D)。THP-1 細胞可以表現微小膠 細胞/巨噬細胞表面標記，例如: CD11a、 CD11b、CD11c、CD18、CD36、
CD44 及 Fc 免疫球蛋白接受器 (Fc-immunoglobin receptors) [6]。以 免疫螢光染色法確認 PMA 誘導 THP-1 細胞可表現微小膠細胞/巨噬細 胞表面標記 CD11b。如圖五，已分化的 THP-1 細胞之 CD11b 螢光表現 量顯著強於未分化的 THP-1 細胞。此結果與 2005 年 Phillips 等人 發表的文獻相符[60]。證明本實驗的 THP-1 細胞經由 10-7 M PMA 處理 4 天，可以誘發 THP-1 細胞分化成類微小膠細胞。
三、不同劑量的 MPP+處理對未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞神經毒性 之影響
本實驗使用未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞來進行下列實驗，未 分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞以不同劑量 MPP+處理 24 小時之後，以 MTT Assay 評估細胞存活率。MTT Assay 由 Mosroann 在 1983 年提出，
是一種快速呈色法，MTT 經由活細胞中的粒線體琥珀脫氫酵素作用後 會形成藍色的沉澱 MTT-formazan 產物，經 10% SDS 將沉澱溶解成均 質溶液後，用 570 nm 波長檢測其吸光值並分析數據，若吸光值越大 表示細胞存活率越高 (圖六)。 結果顯示，未分化的 SH-SY5Y 細胞分 別以 MPP+ 濃度 0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM 處理 24 小時後，將控制組 (0 mM)的 SH-SY5Y 細胞之存活率百分比設定為 100，則處理組 (0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM)的細胞存 活率百分比分別是 95.75、85.61、75.54、69.10、53.67、42.23、
43.95，隨劑量增加細胞死亡率越高。且在 MPP+濃度 1.0 mM 下處理 24 小時可造成顯著細胞死亡，統計上有顯著差異 (*
p
＜0.05) 。已 分化的 SH-SY5Y 細胞之處理組 (0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM)的細胞存活率百分比分別是 93.75、91.82、83.19、82.89、60.93、65.82、51.12，且在 MPP+濃度 3.0 mM 下處理 24 小時可造成顯著細胞 死亡，統計上有顯著差異 (*
p
＜0.05) 。綜合結果顯示，未分化比已分化的 SH-SY5Y 細胞對 MPP+較為敏感。
四、不同劑量的 MPP+處理對未分化及已分化的 THP-1 細胞毒性之影響 本實驗使用未分化及已分化的 THP-1 細胞來進行下列實驗，未分 化及已分化的 THP-1 細胞以不同劑量 MPP+處理 24 小時之後，以 MTT Assay 評估細胞存活率 (圖七)。結果顯示，未分化的 THP-1 細胞以 MPP+ 濃度 0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM 處理 24 小時 後，將控制組 (0 mM)的 THP-1 細胞之存活率設為 100%，則處理組 (0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM)的細胞存活率百分比分別 是 94.83、90.43、79.27、47.92、29.65、23.99 及 19.90，隨劑量 增加細胞死亡率越高。且在 MPP+濃度 2.0 mM 處理 24 小時之細胞存活 率可顯著引起細胞的死亡，統計上有顯著差異 (*
p
＜0.05)。而已分 化的 THP-1 細胞在 MPP+濃度處理 24 小時，處理組 (0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mM) 的細胞存活率百分比分別是 99.83、98.35、
95.03、84.39、73.24、74.44、61.58，隨劑量增加細胞死亡率越高。
且在 MPP+濃度 3.0 mM 處理 24 小時可顯著引起細胞的死亡，統計上有 顯著差異 (*
p
＜0.05)。綜合結果顯示，未分化比已分化的 THP-1 細 胞對 MPP+較為敏感。五、抗氧化劑對 MPP+處理之未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞毒性之影 響
由於過去有文獻指出 MPP+造成神經細胞的傷害與反應性氧族 (reactive oxygen species, ROS) 的生成增加有關[1, 3]，因此本實驗 測 MPP+處理造成神經細胞毒性，是否可經由抗氧化劑減少 MPP+引起的 神經毒性。本實驗分別使用未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞來進行下 列實驗，未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞分別以維生素 C (0、50、
100 μM) 或維生素 E (0、50、100 μM)，與不同劑量 MPP+ (0、0.5、
1.0、2.0、3.0 mM) 共同處理 24 小時之後，以 MTT Assay 評估細胞 存活率。在未分化的 SH-SY5Y 細胞結果顯示，50、100 μM 濃度之維 生素 C (圖八 A) 在統計上無法有效減低 MPP+引起的神經毒性 (
p
＞ 0.05)。在 50、100 μM 濃度之維生素 E 處理組 (圖八 B) 亦無法有 效改善 MPP+處理的神經毒性 (p
＞0.05) 。同樣的在已分化的 SH-SY5Y 細胞結果顯示 (圖九)，維生素 C 和維生素 E 皆沒有減低 MPP+引起的 神經毒性，即統計上並無顯著差異。六、利用 DAPI 染色觀察抗氧化劑對 MPP+處理之未分化的 SH-SY5Y 細 胞核型態之變化
有文獻指出 MPP+處理可引起細胞凋亡[76]，本實驗進一步以 DAPI 螢光染色方式，觀察維生素 C 是否可以降低 MPP+引起的細胞凋亡。以 100 μM 的維生素 C 單獨處理或與 MPP+共同處理未分化的 SH-SY5Y 細 胞 24 小 時 後 ， 以 DAPI 染 色 觀 察 細 胞 核 型 態 之 改 變 。 DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) 是一種可以穿透過完整的細胞 膜，並且與細胞之雙股 DNA 之 A-T 鹼基結合的螢光染料，激發波長 為 360 nm，發射波長為 460 nm，其發散光的波長範圍含蓋了藍色至 青綠色。細胞凋亡可分為 3 期:凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）
的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多的空泡結構；Ⅱa 期細胞核的 染色質皺縮 (condensation)、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂 解為碎塊，產生凋亡小體 (apoptosis body) 等形態。每組處理中隨 機取樣 100 個細胞，計算凋亡小體的數目，並以凋亡百分比呈現數 據。結果顯示 0.5 mM MPP+處理的 SH-SY5Y 細胞核有少數可觀察到 apoptotic nuclei，比例為 2.27 % (圖十 B)。100μM 維生素 C 和 0.5 mM MPP+共同處理的 SH-SY5Y 細胞中出現 apoptotic nuclei 為 1.09 % (圖十 D)。結果顯示，雖然維生素 C 與 MPP+共同處理組有較低比例的 apoptotic nuclei，但統計上無顯著差異。
七、以西方轉漬法偵測 phospho-p38 在 MPP+處理之未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞之角色
由於已分化比未分化的 SH-SY5Y 細胞對 MPP+毒性較不敏感。且之 前有文獻指出神經細胞分化時 p38 佔非常重要角色[57]，且與細胞凋亡 有關。但也有文獻指出 MPP+與 p38 並無關聯[33]。因此，有其必要進一 步探討 phospho-p38 在 MPP+處理未分化及已分化 SH-SY5Y 細胞毒性之 角色。由圖六結果可知，1 mM MPP+處理只會在未分化的細胞上造成 顯著細胞死亡。而已分化的細胞則需 3 mM MPP+處理才會有顯著的細 胞死亡。本實驗分別使用未分化及已分化的 SH-SY5Y 細胞予不同劑量 MPP+ (0、1.0、3.0 mM) 共同處理 24 小時之後，收集細胞蛋白質，
以西方轉漬法觀察 phospho-p38 的表現量（圖十一）。結果發現 MPP+ 處理可增加 phospho-p38 的表現量。顯示 MPP+引發的細胞毒性可能是 藉由 phospho-p38 的增加的途徑。已分化 SH-SY5Y 細胞有最低量的 phospho-p38 表現，這可能是因為維生素 A 酸可抑制 p38 的磷酸化
[57]。而 MPP+濃度 1.0 mM 處理已分化的 SH-SY5Y 細胞因 phospho-p38 表現量降低 ，所以細胞死亡率比同樣 MPP+濃度 1.0 mM 作用於未分化 SH-SY5Y 細胞上來得低。而 MPP+濃度 3.0 mM 處理已分化的 SH-SY5Y 細胞之 phospho-p38 表現量增加，所以可造成明顯的細胞死亡，這結 果與圖六 MPP+ 3.0 mM 才造成顯著的細胞死亡相符。實驗結果顯示，
MPP+處理造成的細胞死亡可能是經由 p38 的途徑。
八、MPP+處理對已分化 THP-1 細胞與已分化的 SH-SY5Y 細胞共同培養 模式之影響
本實驗使用已分化的 THP-1 與已分化的 SH-SY5Y 細胞，作為類微 小膠細胞-神經細胞共同培養模式。將 1×105 THP-1 細胞種至 18×18 mm 的玻片上 (已先在玻片的四個角落滴上牙科蠟)，以 10-7 M PMA 培養 4 天誘發細胞分化。將 2×105 SH-SY5Y 細胞種至 6 孔盤上，以 10-5 M 維生素 A 酸培養 3 天誘發細胞分化。再將 THP-1 細胞的玻片移至 6 孔盤的 well 內進行共同培養。同時，選擇分別皆不會造成 SH-SY5Y 和 THP-1 細胞顯著死亡的 MPP+ (0.5、1、2 mM) 濃度處理 24、48、
72 小時，以 MTT Assay 評估 SH-SY5Y 細胞存活率 (圖十二)。單獨培 養及共同培養的 SH-SY5Y 細胞以 MPP+不同劑量處理 24 小時之結果顯 示，以未處理且單獨培養的 SH-SY5Y 細胞作為控制組，存活率為 100%。處理組 (0.5、1.0 mM) 於單獨培養的 SH-SY5Y 的細胞存活率 百分比分別是 91.24、89.32，共同培養的 SH-SY5Y 的細胞存活率百 分比分別是 84.73、74.45。統計結果顯示，在 MPP+濃度 1.0 mM 處理 24 小時，於共同培養比單獨培養的 SH-SY5Y 細胞有明顯的存活率下 降 (*
p
<0.05)。而單獨培養及共同培養的 SH-SY5Y 細胞以 MPP+不同 劑量處理 48 或 72 小時後，單獨與共同培養的 SH-SY5Y 細胞之間的存活率皆無顯著差異 (
p
＞0.05)。綜合結果，THP-1 可能會加重 MPP+ 的神經毒性。且 THP-1 對 MPP+的神經毒性造成的影響，可能是於 24 小時以內的短期效應。九、抗氧化劑對 MPP+在已分化 THP-1 細胞與已分化的 SH-SY5Y 細胞共 同培養模式之影響
本實驗使用已分化的 THP-1 與已分化的 SH-SY5Y 細胞，作為類微 小膠細胞-神經細胞共同培養模式。將 1×105 THP-1 細胞種至 18×18 mm 的玻片 (已先在玻片的四個角滴上牙科蠟) 上，以 10-7 M PMA 培養 4 天誘發細胞分化。將 2×105 SH-SY5Y 細胞種至 6 孔盤上，以 10-5 M RA
本實驗使用已分化的 THP-1 與已分化的 SH-SY5Y 細胞，作為類微 小膠細胞-神經細胞共同培養模式。將 1×105 THP-1 細胞種至 18×18 mm 的玻片 (已先在玻片的四個角滴上牙科蠟) 上，以 10-7 M PMA 培養 4 天誘發細胞分化。將 2×105 SH-SY5Y 細胞種至 6 孔盤上，以 10-5 M RA