研究方法

3.4.1 病毒 DNA 萃取

病毒 DNA 萃取（purification of viral DNA）首先將 BC-3 細胞株 經培養後之培養液（含 HHV-8 病毒）每 1ml 分裝入 1.5ml 離心管，加入 200 μl PEG2000/ 2.5M NaCl 混合後，放入 37℃培養箱搖晃一小時。離 心，10K rpm10 分鐘，小心的完全去掉上清液，將沈澱物溶於 200 μl 二 次水中，再加入 200 μl phenol/ chloroform（USP, USA），搖晃均勻。

離心 12000 rpm 15 分鐘。取上清液 150μl 加入 300μl ethanol（Sigma, USA）。置於-80℃冰箱 1 小時。離心,10,000 rpm 10 分鐘，小心的完全 去掉上清液，用 70% ethanol 清洗沈澱物後置於室溫中晾乾，再加入 30μl 二次水。之後將 HHV-8 DNA 進行 PCR 與OD 值的測量。

3.4.2 巢式聚合酵素連鎖反應

巢式聚合酵素連鎖反應（nested polymerase chain reaction,

nested PCR）同時兼具敏感性與特異性，其詳細步驟與條件如下列描述。

(1) Primer 序列

1^st：KS1、KS2(Dupon et al., 1997)

KS1：5’-AGCCGAAAGGATTCCACCAT–3’

KS2：5’-TCCGTGTTGTCTACGTCCAG–3’

2^nd：NS1、NS2(Monini et al., 1996)

NS1 : 5 –ACGGATTTGACCCCGTGTTC–3’

NS2 : 5 –AATGACACATTGGTGGTATA–3’

(2) Nested PCR 反應溶液之配置 a. 模板（Template） 2.5μl b. Primer（100uM） 各 1μl

c. 去氧核苷三磷酸（10mM）（Promega, USA）0.5μl d. Taq Buffer（GeneTeKs） 5μl

e. OptiPol^TM DNA Polymerase（5u/μl）（GeneTeKs）0.5μl f. 最終體積以滅菌蒸餾水調製成 50μl

(3) Nested PCR 反應步驟

Nested PCR 共有兩次 PCR 反應，第一次 PCR 以病人 DNA 為

Template，反應步驟為 94℃、5 分鐘作為預變性（pre-denature），

其次以 94℃、1 分鐘；58℃、1 分鐘；72℃、1 分鐘的條件循環反應 40 次，最終設定 72℃、15 分鐘，使產物反應更完全。第一次 PCR 反 應產物為 233 個核苷酸（base pair, bp），從反應溶液取 2.5μl 作 為第二次 PCR 的 Template。第二次 PCR 反應步驟為 94℃、5 分鐘作 為預變性（pre-denature），其次以 94℃、30 秒；58℃、30 秒；72℃、

30 秒的條件循環反應 40 次，最終設定 72℃、15 分鐘，使產物反應 更完全。第二次 PCR 產物為 160bp。陽性控制組（positive control）

的 Template 為 HHV-8 病毒 DNA，陰性控制組（negative control）

的 Template 為滅菌二次水，以了解 PCR 效能與汙染的控制。PCR 結 果以 2％瓊酯凝膠（2％ agarose gel）進行電泳分析，並將陽性個 案之序列進行定序分析。

3.4.3 HHV-8 蛋白純化

本研究純化了 HHV-8 ORF66 與 ORFK12 之蛋白。ORF66 分子量為 47022.16 Daltons，功能為類似 EBV BFRF2 homolog；ORFK12 分子量為 6440.28 Daltons，功能為 kaposin。由於本研究以 pET32a 為載體，因此 最後純化出來的蛋白質分子量需加上 pET32a 本身的蛋白，如

thioredoxin。

（1）聚合酵素連鎖反應

先針對 ORF66 與 ORFK12 基因片段進行聚合酵素連鎖反應

（PCR），詳細步驟與條件如下列描述。

1. Primer 序列

ORF 66： 5’ –TATCGGATCCATGGCCCTGGATCAGC - 3’

5’ –GGTGCTCGAGGGAGGAACACTTCCCG - 3’

ORF K12：5’ - TCGCGGATCCATGGATAGAGGCTTAA - 3’

5’ - CGCACTCGAGGTGCGCGCCCGTTGCA - 3’

2. PCR 反應溶液之配置

a. 模板（Template） 5μl b. Primer（100uM）各 2μl

c. 去氧核苷三磷酸（10mM）（Promega, USA）1μl d. Taq Buffer（GeneTeKs） 10μl

e. OptiPol^TM DNA Polymerase（5u/μl）（GeneTeKs）1μl 最終體積以滅菌蒸餾水調製成 100μl

3. PCR 反應步驟

ORF66 為 1290bp，PCR 反應為為 94℃、5 分鐘作為預變性

（pre-denature），其次以 94℃、1 分鐘；52℃、1 分鐘 30 秒；

72℃、1 分鐘 45 秒的條件循環反應 40 次，最終設定 72℃、15 分鐘，使產物反應更完全。

ORFK12 為 182bp，PCR 反應為為 94℃、5 分鐘作為預變性

（pre-denature），其次以 94℃、30 秒；52℃、30 秒；72℃、

30 秒的條件循環反應 40 次，最終設定 72℃、15 分鐘，使產 物反應更完全。

（2）限制酵素的水解

PCR 得到的產物，以 Spin PCR Clean-Up system 試劑套組

（ Viogene ）將 DNA 純化後，以 80 μl 的 ddH²O 將 DNA 溶出，加入 10X reaction buffer( Fermentas) 10μl 及 切 位 的 限 制 酵 素

（10u/μl）（Fermentas）5 μl，使總體積為 100μl，以 37℃作用 隔夜。相對應的質體載體亦以同樣的方式進行限制酵素的水解，來 構築實驗的表現載體。ORF66 與 ORFK12 所使用的之切位酵素為 BamH Ι、XhoΙ。

（3）質體的構築 : DNA 接合

質體載體 pET32a 1μl，加上欲接合(ligation)的 DNA（ORF 66 與 ORFK12） 7μl，10X ligation buffer（Fermentas） 1μl，濃 度為 5 Weiss unit/μl 的 T4 ligase（Fermentas） 1μl，以 16℃

作用隔夜。

（4）適應性細胞的製備

適 應 性 細 胞 (competent cell) 為 培 養 隔 夜 的

E. coli

（Top10、BL21）2ml，倒入 200ml LB 中，以 37℃ 培養箱培養二至 三小時達到 log phase，取出置於冰上靜置十分鐘後，再以 3000rpm、

4℃、離心 15 分鐘，取出倒掉上清液，以 0.1M CaCl² resuspend pellet。於冰上靜置培養三十分鐘後，同樣再以 3000rpm，4℃，離 心十五分鐘，取出後小心地倒掉上清液，再加入 0.1M CaCl² 1.6ml，

glycerol 0.4ml(20%)將 pellet resuspend，然後靜置於冰上二小時 後分裝至 1.5ml 離心管中，每管約含 200μl 左右。

（5）大腸桿菌之轉型

將構築好的質體加入適應性細胞中以進行轉型

（transformation）。兩者混合均勻後至於冰上三十分鐘。在經 42℃

反應 90 秒後，迅速至於冰上三分鐘，之後加入 800μl 不含抗生素 的 LB 培養液。在 37℃ 培養箱培養一小時後，離心去掉上清液，均 勻塗在含抗生素（ampicillin）的 LB 培養基上，抗生素濃度為 50mg/ml。

（6）質體純化

質體純化 (plasmid purification)的步驟首先將含有質體的單 一菌落，以 2ml LB 在 37°C 培養箱搖隔夜後取出，以最大速離心

12,000rpm 五 分 鐘 後 ， 倒 掉 上 清 液 ， 用 Gene-Spin^TM Miniprep Purification Kit 試劑組 ( Protech technology )來純化質體。

以 solution I 溶液 200μl resuspend pellet，加入 solution II 溶液 200μl 上下倒置數次後，再加入 solution III 溶液 200μl 上下倒置數次，最大速離心五分鐘。將 spin column 插入一收集管

（collection tube）中，離心後的上清液移至 spin collumn 中，

離心 30 秒，移除濾液後，加入 700μl Washing solution，離心一 分鐘。再將收集管以 1.5ml 微量離心管置換，加入 20μl ddH²O 回收 質體。

（7）誘導大腸桿菌上乳糖啟動子（

lac

經過定序確認所需之 DNA 片段已構築於載體上後，將含有融合 蛋白的實驗菌株培養在 10ml LB 培養液，隔天加到 500ml 的 LB broth ，培養箱中 37℃培養二到三小時，吸光值 OD⁶⁰⁰nm 約為 0.4 到 1 之間，加入 IPTG（0.8M）500μl，最終濃度為 0.8mM，再經 16℃

培養隔夜，將菌液收集並且離心，之後加入 20ml 的 10mM imidazole。

再置於超音波擊碎機（sonicator）將細胞打碎。本實驗之載體為 pET32a，實驗菌株為 BL21。

（8）純化重組病毒蛋白質

利用 FPLC 純化蛋白，在 column 中裝填 10ml 的 Chelating

Sepharose^TM(Amersham Biocsciences)，將以打碎的細菌溶液離心，

上清液流過鎳離子親和性層析凝膠，先用沖洗緩衝液（100mM imidazole）沖洗，再用析出緩衝液（400mM imidazole）將蛋白質 析出。流程如下：dH²0 總量 250ml，流速 5min/ml→EDTA 總量 20ml，

流速 1min/ml→dH²0 總量 250ml，流速 5min/ml→Ni 總量 15ml，流速 1min/ml→dH²0 總量 250ml，流速 5min/ml→10M Imidazole 總量 60ml，流速 3min/ml→Sample 總量 20ml，流速 1min/ml→10M Imidazole 總量 60ml，流速 3min/ml→100M Imidazole 總量 60ml，

流速 5min/ml，收取 5ml/tube→400M Imidazole 總量 60ml，流速 3min/ml，收取 3ml/tube。

（9）蛋白質濃度測定

純化後的蛋白質濃度用 Bio-Rad protein assay 染劑(取 10ml，

以二次水稀釋到 50ml)進行測試。用牛血清蛋白（bovine serum albumin；BSA）1mg/1ml 為樣品，分配成濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8、

1.0mg/1ml 各 20μl，各別加入 1ml 染劑中，算出線型回歸公式，做 出標準曲線。再取蛋白質樣本 20μl 加入 1ml 染劑，測 OD^595nm的吸光 值，並分析蛋白質濃度。

（10）蛋白質之電泳分析

實驗所使用的電泳裝置為 Bio-Rad 蛋白質電泳槽，待鑄膠裝置

組合後，先加入分離膠體溶液（separating gel），再加入二次水 將上層膠壓平，待凝固後倒掉二次水並擦拭乾後加入集膠溶液

（stacking gel），插上齒膜，膠體凝固後置於電泳槽中，注入電 泳緩衝液（running buffer）。取蛋白質樣本溶液 80μl 加入 2X sample loading buffer 20μl，混勻後在 100 ℃加熱五分鐘後，迅速置於 冰上再注入樣本槽 10μl，並注入蛋白質標準溶液以為對照，先以 80V 進行電泳，待藍色染劑跑到分離膠體時，將電壓調整為 110V 繼 續電泳，直到藍色染劑跑到膠體底部。關閉電源將膠體取出，用 Commassie brilliant blue 染色再用脫色液（Destain solution）

脫色到蛋白質色帶清楚。

（11）西方轉漬分析

實驗所使用的電泳裝置為 Bio-Rad 半乾式的電泳轉漬槽，

SDS-PAGE 後，切除集膠體部份，膠片浸在轉漬緩衝液（Transfer buffer）中。取轉印紙（硝化纖維紙 nitrocellulose paper)切成膠 片大小浸在轉漬緩衝液，先鋪上三張濕潤的 3M 濾紙，後鋪上濕潤的 轉印紙，疊上已濕潤的膠片，再鋪上三張濕潤的 3M 濾紙，過程需趕 走氣泡。轉印紙那面位向正極，膠片那面位向負極，以 200 mA 轉印 一小時三十分鐘。之後，將轉印紙放入 1X TBST 含 0.5％脫脂牛奶，

室溫搖盪一小時，以填塞沒有蛋白質轉印上去的空間。倒掉進行 Blocking 的牛奶，以 1X TBST 清洗十分鐘三次。倒掉 1X TBST，加 入第一次抗體（1：1000 稀釋），放置 4℃隔夜，隔天於室溫搖擺一 小時。倒去第一次抗體，以 1X TBST 清洗十分鐘三次。再加入第二 次抗體（1：1000 稀釋），置於室溫搖擺二小時。倒去二次抗體，轉 印紙以 1X TBST 清洗七分鐘三次。加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈 色（約二十分鐘以內）。加入二次水以終止反應，晾乾後保存。

3.4.4 酵素免疫分析法

在製作完酵素免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）的抗原後，將純化的蛋白，thioredoxin、HHV-8 rORFK12 蛋白、

HHV-8 rORF66 蛋白，分別被覆（coating）在 96well plate 上，濃度為 5μg/ml，4℃靜置隔夜。隔天，倒掉上清液，加 5％脫脂牛奶，每一個 well 200μl，室溫中搖晃一個小時。將脫脂牛奶倒掉後以 1X TBST 每 well 100μl，清洗七分鐘重複三次。清洗完後加入以 1X TBST 稀釋 100 倍的血漿每 well 100μl，每個檢體重複 3 個 well，控制組則不加入血 漿，室溫搖晃一個小時。將血漿完全除去，以 1X TBST 每 well 100μl，

室溫中清洗七分鐘三次。加入以 1X TBST 稀釋五萬倍的二抗 anti-human

IgG peroxidase，每 well 100μl 室溫中搖晃一個小時。倒去二抗後以 1X TBST 每 well 100μl，室溫中清洗七分鐘三次。接著以 1 比 1 加入 ABTs Peroxidase Substrate（KPL）與 Peroxidase Solution B（KPL），每 well 共 50μl 呈色二十分鐘，加入 stop solution（50μl / well ）立刻測

OD ^405nm 吸光值。

每個檢體皆進行三重複，測得 OD 值後，以較相近的兩個值取其平均 作為檢驗結果。另外，以被覆 thioredoxin 的 plate 之 OD 值為基準，HHV-8 rORFK12 蛋白、HHV-8 rORF66 蛋白所測出來的 OD 值與之相除。若 OD 值 HHV-8 rORFK12/thioredoxin 超過 1.2 則判別為血漿中 HHV-8 rORFK12 抗 體陽性；同理，若 OD 值 HHV-8 rORF66/thioredoxin 超過 1.2 則判別為 血漿中 HHV-8 rORF66 抗體陽性。若 HHV-8 rORFK12 抗體、HHV-8 rORF66 抗體皆呈陽性，則定義為曾遭受 HHV-8 感染，即 HHV-8 ELISA 陽性個案。

3.4.5 以西方轉漬分析技術進行陽性確認

此方法主要用來進行二次確認。一開始的步驟與 3.3.4 中所陳述的 西方轉漬分析一樣，較不同的地方在於鑄膠時將齒模以膠帶封住，只留 下一個 well 可以注入 maker，其他齒槽合併為一，注入 thioredoxin、

HHV-8 rORFK12 蛋白、HHV-8 rORF66 蛋白。

以 Bio-Rad 半乾式的電泳轉漬槽進行轉漬完成後，將轉印紙以 1x

TBST 含 0.5％脫脂牛奶，室溫搖盪一小時，以填塞沒有蛋白質轉印上去 的空間。將轉印紙剪成條狀，每一條分別加入稀釋 100 倍的血漿當作第 一次抗體，控制組則是加入稀釋 1000 倍的 mouse anti-his tag antibody 為一抗，室溫中搖盪一小時。倒去第一次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘 三次。加入稀釋 1000 倍的第二次抗體 anti-human IgG AP labeled antibody，控組組則是加入 anti-mouse IgG AP labeled antibody，室 溫搖盪一小時。倒去第二次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘三次。加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色（約二十分鐘以內）。加入二次水以終止反

TBST 含 0.5％脫脂牛奶，室溫搖盪一小時，以填塞沒有蛋白質轉印上去 的空間。將轉印紙剪成條狀，每一條分別加入稀釋 100 倍的血漿當作第 一次抗體，控制組則是加入稀釋 1000 倍的 mouse anti-his tag antibody 為一抗，室溫中搖盪一小時。倒去第一次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘 三次。加入稀釋 1000 倍的第二次抗體 anti-human IgG AP labeled antibody，控組組則是加入 anti-mouse IgG AP labeled antibody，室 溫搖盪一小時。倒去第二次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘三次。加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色（約二十分鐘以內）。加入二次水以終止反