第四章、 結果
4.4 酵素免疫分析法
在製作完酵素免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）的抗原後，將純化的蛋白，thioredoxin、HHV-8 rORFK12 蛋白、
HHV-8 rORF66 蛋白，分別被覆（coating）在 96well plate 上，濃度為 5μg/ml，4℃靜置隔夜。隔天，倒掉上清液，加 5％脫脂牛奶，每一個 well 200μl，室溫中搖晃一個小時。將脫脂牛奶倒掉後以 1X TBST 每 well 100μl，清洗七分鐘重複三次。清洗完後加入以 1X TBST 稀釋 100 倍的血漿每 well 100μl，每個檢體重複 3 個 well，控制組則不加入血 漿，室溫搖晃一個小時。將血漿完全除去，以 1X TBST 每 well 100μl，
室溫中清洗七分鐘三次。加入以 1X TBST 稀釋五萬倍的二抗 anti-human
IgG peroxidase，每 well 100μl 室溫中搖晃一個小時。倒去二抗後以 1X TBST 每 well 100μl，室溫中清洗七分鐘三次。接著以 1 比 1 加入 ABTs Peroxidase Substrate（KPL）與 Peroxidase Solution B（KPL），每 well 共 50μl 呈色二十分鐘，加入 stop solution（50μl / well ）立刻測
OD 405nm 吸光值。
每個檢體皆進行三重複，測得 OD 值後，以較相近的兩個值取其平均 作為檢驗結果。另外，以被覆 thioredoxin 的 plate 之 OD 值為基準，HHV-8 rORFK12 蛋白、HHV-8 rORF66 蛋白所測出來的 OD 值與之相除。若 OD 值 HHV-8 rORFK12/thioredoxin 超過 1.2 則判別為血漿中 HHV-8 rORFK12 抗 體陽性；同理，若 OD 值 HHV-8 rORF66/thioredoxin 超過 1.2 則判別為 血漿中 HHV-8 rORF66 抗體陽性。若 HHV-8 rORFK12 抗體、HHV-8 rORF66 抗體皆呈陽性，則定義為曾遭受 HHV-8 感染，即 HHV-8 ELISA 陽性個案。
3.4.5 以西方轉漬分析技術進行陽性確認
此方法主要用來進行二次確認。一開始的步驟與 3.3.4 中所陳述的 西方轉漬分析一樣，較不同的地方在於鑄膠時將齒模以膠帶封住，只留 下一個 well 可以注入 maker，其他齒槽合併為一，注入 thioredoxin、
HHV-8 rORFK12 蛋白、HHV-8 rORF66 蛋白。
以 Bio-Rad 半乾式的電泳轉漬槽進行轉漬完成後，將轉印紙以 1x
TBST 含 0.5％脫脂牛奶，室溫搖盪一小時，以填塞沒有蛋白質轉印上去 的空間。將轉印紙剪成條狀，每一條分別加入稀釋 100 倍的血漿當作第 一次抗體，控制組則是加入稀釋 1000 倍的 mouse anti-his tag antibody 為一抗，室溫中搖盪一小時。倒去第一次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘 三次。加入稀釋 1000 倍的第二次抗體 anti-human IgG AP labeled antibody，控組組則是加入 anti-mouse IgG AP labeled antibody，室 溫搖盪一小時。倒去第二次抗體，以 1X TBST 清洗七分鐘三次。加入 NBT/TCIP 顯色劑，反應至呈色（約二十分鐘以內）。加入二次水以終止反 應，晾乾後保存。
呈色結果在控制組會有 3 條蛋白質片段，分別為 thioredoxin
（20KDa）、HHV-8 rORFK12 蛋白（26KDa）、HHV-8 rORF66 蛋白（67Kda）。 而實驗組若同時對 rORFK12、rORF66 蛋白具有抗體反應，則判定為陽性。
3.5 統計方法
使用 Microsoft Excel 2003 進行資料建檔與處理，SAS 8.0 統計軟 體進行分析。在愛滋病帶原者，利用 t-test 檢定 HHV-8 陽性與 HHV-8 陰 性兩組之連續變項如年齡、CD4、HIV 病毒量之差異性；並以卡方檢定
（χ2-test）與費雪氏檢定（Fisher’s exact test）來探討與其他類別 變項如性別、HAART 的使用、傳染途徑之相關。最後用邏輯斯迴歸
（logistic regression model）作多重危險因子多變項迴歸分析。在糖 尿病患者中，以上述方法探討 HHV-8 陽性與年齡、性別、糖化血色素（A1c）
之相關性，並計算相對危險性及 95%信賴區間。
3.6 使用藥劑
詳情於附錄中
3.7 使用儀器
詳情於附錄中
第四章、結果
4.1 檢驗方法的建立
4.1.1 巢式聚合酵素連鎖反應
巢式聚合酵素連鎖反應（nested PCR）需進行兩次 PCR 反應，如圖 一所示，第一次反應產物為 233bp，第二次反應產物為 160bp。圖二為檢 體進行巢式聚合酵素連鎖反應之電泳圖，第一次 PCR 反應時訊號較微弱，
因此只有 positive control 具有 HHV-8 DNA 陽性反應；第二次 PCR 反應 時，圖三的 lane 10 與 positive control 皆具有特異性片段 160bp，因 此 lane 10 便被判別為 HHV-8 DNA 陽性。以巢式聚合酵素連鎖反應為一 黃金標準進行酵素免疫分析法之 OD 值切點之決定。
4.1.2 建立ORF66與ORFK12之重組蛋白
4.1.2.1 藉聚合酵素連鎖反應進行基因選殖
以 HHV-8 DNA 為 Template，進行 ORF66 與 ORFK12 的 DNA 片段放大，
圖四為 PCR 反應後的電泳結果。ORF66 的 PCR 反應片段為 1290bp，ORFK12 的 PCR 反應片段為 183bp。
4.1.2.2 載體送入適應性細胞後的篩選
將 ORF66 與 ORFK12 與 pET32a 接合之後，將重組後的 DNA 送入適應
性細胞 TOP10，再由菌液中純化質體（plasmid purification）進行 PCR 反應，以確認 rORF66、rORFK12 建立完成。圖五為 PCR 反應後的電泳圖，
隨機挑選 16 個不同 TOP10 菌落，放大為 16 管菌液進行純化質體後，以 之為 Template 進行 PCR 反應，若 PCR 反應為陽性表示 ORF66 與 ORFK12 已經成功的重組於 pET32a。確認 PCR 反應產物之片段大小無誤之後，將 PCR 反應溶液進行 DNA 定序，再次確定重組 DNA 無誤。
4.1.2.3 蛋白質純化
本研究所純化的蛋白，於質體純化後經過定序確認 DNA 片段無誤，
圖六為蛋白質純化後，使用蛋白質之電泳分析與西方轉漬分析確認蛋白 質分子量無誤。另外，蛋白質分子量必須加上原本 pET32a 本身的表現蛋 白，因此 HHV-8 ORF66 分子量約為 67kDa（Daltons），HHV-8 ORFK12 分 子量約為 26kDa，thioredoxin 約為 20kDa。
4.1.3 以酵素免疫分析法（ELISA）進行大量篩檢
圖七為 HHV-8 ELISA 陽性控制組，其 ELISA 與 nested PCR 皆為陽性 反應。圖八為 HHV-8 ELISA 陰性控制組，其 ELISA 與 nested PCR 皆為陽 性反應。
診斷標準切點的決策中，判定的準則首先以 nested PCR 結果做為參
考，計算出以 0.9 至 1.7 作為切點時的敏感度（sensitivity）與特異度
（specificity），製作出 ROC 曲線（receiver operator characteristic curve）後決定以 1.2 為較適當的切點（圖九）。
4.1.4 以西方轉漬分析技術進行 HHV-8 ELISA 陽性再確認
利用西方轉漬分析，將病毒蛋白當做抗原，愛滋病毒帶原者之血漿 為第一次抗體進行特異性抗體的篩檢，一張轉印紙可檢驗約 10 個血漿檢 體。圖十為呈色後的結果，以 thioredoxin 作為控制組，因此若一抗為 愛滋病毒帶原者之血漿，則在 20kDa 處不應有 band 的產生，若不符合此 結論之檢體有陽性反應，將被判別為偽陽性。
4.2 研究對象基本人口學特性
於表一同時比較在愛滋病毒帶原者、糖尿病患者、一般族群中，HHV-8 ELISA 陽性個案於年齡與性別所佔的比例。在小於 30 歲的糖尿病患中，
沒有 HHV-8 ELISA 陽性個案，是因為在此族群平均年齡偏高所導致的。
4.2.1 愛滋病毒帶原者
本研究共有 176 人，平均年齡 32.73±8.75 歲，CD4 數目平均為 477.5
±229.28，CD8 數目平均為 1247.22±622.35。本研究族群男性居多（89.2
％），以病歷資料進行判斷發現 8.52％曾罹患後天免疫缺乏症候群 (Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，全部的病人皆被檢驗 出帶有愛滋病病毒。
4.2.2 糖尿病患者
糖尿病患者共有 301 人，平均年齡 62.6±11.74 歲，男性佔 44.19％，
女性佔 55.81％，用來監測血糖的 HbA1c 平均為 0.07±0.01。
4.2.3 ㄧ般族群
ㄧ般族群共 100 人，平均年齡為 25.88±11.38 歲，60 位男性（60％）
與 40 位女性（40％）。
4.3 巢式聚合酵素連鎖反應
對 176 位愛滋病毒帶原者之 DNA 以巢式聚合酵素連鎖反應篩檢後，
HHV-8 DNA 陽性有 13 人（7.39％），陽性個案部分經由定序確認片段無誤。
由表二可得知，愛滋病毒帶原者其血液是否有 HHV-8 DNA 與其年齡、性 別、被 HIV 帶原者傳染之方式、HIV 病毒量、CD4 數目、後天免疫不全症 候群無統計上顯著的相關（
p-value
＞0.05）。以邏輯斯回歸模式進行變 項的調整年齡、性別、HIV 病毒量、CD4 數目後，沒有發現其他顯著相關因子存在。
4.4 酵素免疫分析法
愛滋病毒帶原者、糖尿病患者、一般族群之血漿以酵素免疫分析法 進行大量篩檢，發現血清盛行率分為別 61.93％、36.21％、10％。
表三為探討在愛滋病毒帶原者中，HHV-8 ELISA 陽性與其他因子之間 的相關性，發現傳染方式與 ELISA 陽性之間有顯著的相關（
p-value
＜ 0.0001），表四為利用邏輯斯回歸分析經過其他變項的調整後，Model 1 調整了年齡、性別、傳染方式、血漿中 HIV 病毒量、CD4 數目、HHV-8 DNA 檢測結果、後天免疫不全症候群情況，Model 2 則針對傳染方式、CD4 數 目、HIV 病毒量進行調整。在 Model 2 中，HIV 病毒量越高者，HHV-8 ELISA 陽性的勝算就越高；CD4 數目超過 200 cells/mm 3其 HHV-8 ELISA 陽性勝 算比小於 200 cells/mm 3高；靜脈注射傳遞者的 aOR 値（adjusted odds ratio）為 0.11（95％C.I：0.05~0.28），可推測性行為傳遞者比靜脈注 射傳遞者還容易感染 HHV-8。表五為糖尿病患者 HHV-8 ELISA 陽性與基本 變項之多變項邏輯斯回歸模型，在經過變項調整分析後，於年齡、性別、HbA1c 沒有發現相關性存在。