第三章、 材料與方法
三、 研究方法
參與研究的孕婦均已完成問卷調查，內容包括人口學資料、生產史、
疾病史、吸菸暴露狀態等。依據孕婦填答的問卷內容，區分為吸菸組、
二手菸組與非吸菸組。本研究所定義的「吸菸」，指的是孕婦在問卷中回 答目前有吸菸或是已經戒菸；暴露狀態為「二手菸」的孕婦則是指排除 吸菸個案後，在問卷中回答配偶有吸菸習慣或是在工作場所內可聞到菸
味的個案；暴露狀態為「非吸菸」的個案則代表那些不屬於吸菸與二手 菸個案的孕婦。
2. 分析方法.
（1） 血液及尿液可丁寧測定及分析方法由本校環境醫學研究所郭憲文 教授之研究室進行實驗。
（2）每位受測者之血液均放入含 EDTA 抗凝血採血管收集編號之，
並儲存於 4℃冰箱內，以抽取 DNA 並進行基因型之分析。
（3）生產時收集孕婦血液並在 24 小時之內，由本研究室楊建智學長完 成彗星試驗。
3. DNA 萃取
將先前離心好的白血球取出後，加入三倍白血球體積之 1X RBC lysis buffer，搖晃均勻後置於冰上 15 分鐘。離心 1200 rpm 15 分鐘，去除上清 液後重複上述動作一次，之後加入1 ml 的 GenoMarker reagent。在室溫下 靜置5 分鐘。之後加入 0.5 ml chloroform 上下搖晃均勻，離心 12,000 rpm，
4℃ 5 分鐘。取出上清液放入新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 0.5 ml isopropanol，上下搖動直到出現白色 DNA 絲。在 4℃下離心 12,000 rpm，
10 分鐘，小心去除上清液，加入 0.3 ml 70％ ethanol，離心 12,000 rpm，
10 分鐘，去除上清液後，此步驟再重複一次。移除上清液後，將管子倒
置隔夜晾乾，之後將DNA 溶於 10％ TE buffer 100 μl 中隔夜消化後，以 1％ agarose gel 進行前測。完成後置於 －20℃冰箱中保存。
4. 基因型檢定
以聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）--限制片段長度 多型性（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）方法，對 XRCC1、XRCC3、XPD 及 hMLH1 基因進行基因型檢定（28）。
I. XRCC1（codon399）polymorphism
（1）Primer 序列
5'- TTGACCCCCAGTGGTGCTAA -3' 5'- GGCTGGGACCACCTGTGTT -3'
（2）PCR 反應溶液之配置 a. DNA 2 μl
b. XRCC1 primer 各 1 μl
c. 去氧核苷三磷酸（dNTP）5 μl d. Pro Taq buffer 5 μl
e. Taq 聚合酶（Taq polymerase）1 μl f. 最終體積以蒸餾水調製成 50 μl
（3）PCR 反應步驟
94℃、4 分鐘作為預變性（pre-denature），其次以 94℃、40 秒；
58℃、30 秒；72℃、40 秒的條件循環反應 35 次，最終設定 72℃、10 分
II. XRCC3（codon241）polymorphism
（1）Primer 序列
5'- TCGCCTGGTGGTCATCGACTC -3' 5'- GCATCCTGGCTAAAAATACGAGC -3'
（2）PCR 反應溶液之配置 a. DNA 2 μl
b. XRCC3 primer 各 1 μl
c. 去氧核苷三磷酸（dNTP）5 μl d. Pro Taq buffer 5 μl
e. Taq 聚合酶（Taq polymerase）1 μl f. 最終體積以蒸餾水調製成 50 μl
（3）PCR 反應步驟
94℃、4 分鐘作為預變性，其次以 94℃、40 秒；55℃、30 秒；
72℃、40 秒的條件循環反應 35 次，最終設定 72℃、10 分鐘，使產物延 展更完全。之後在PCR 產物內加入 NlaIII 限制酶、限制酶反應液、BSA 及蒸餾水，共20 μl，並置於 37℃水浴槽內 3 小時。再以 3％ agarose gel 進行電泳分析。
聚合酶鏈鎖反應產物為 207 bp。XRCC3 Thr / Thr（野生型）兩條 對偶基因不具有NlaIII 限制酶切割點，故電泳結果只有一個 DNA 片段，
其長度為207 bp。若屬於 Met / Met（變異型），因兩個對偶基因含有一個
NlaIII 限制酶切割點，故可切成兩個 DNA 片段：104 bp 與 103 bp。若同 時出現207 bp、104 bp 與 103 bp 的 DNA 片段則為 Thr / Met（野生變異 型）。但是在全體研究對象中無發現Met / Met 基因型的人。
1: XRCC3 Thr / Thr（野生型）
2: XRCC3 Thr / Met（野生變異型）
M: Maker
III. XPD（codon751）polymorphism
（1）Primer 序列
5'- AGGATCAGCTGGGCCTGTCCCTGC -3' 5'- TGTGGACGTGACAGTGAGAAAT -3'
（2）PCR 反應溶液之配置 a. DNA 2 μl
M 1 2
500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
207 bp 104 bp 103 bp
b. XPD primer 各 1 μl
c. 去氧核苷三磷酸（dNTP）5 μl d. Pro Taq buffer 5 μl
e. Taq 聚合酶（Taq polymerase）1 μl f. 最終體積以蒸餾水調製成 50 μl
（3）PCR 反應步驟
94℃、4 分鐘作為預變性，其次以 94℃、40 秒；55℃、30 秒；
72℃、40 秒的條件循環反應 35 次，最終設定 72℃、10 分鐘，使產物延 展更完全。之後在PCR 產物內加入 MboII 限制酶、限制酶反應液及蒸餾 水，共20 μl，並置於 37℃水浴槽內 3 小時。再以 3％ agarose gel 進行電 泳分析。
聚合酶鏈鎖反應產物為 220 bp。XPD Lys / Lys（野生型）兩條對 偶基因具有一個MboII 限制酶切割點，故電泳結果有二個 DNA 片段，其 長度為140 bp 和 80 bp。若屬於 Gln / Gln（變異型），因兩個對偶基因不 具有MboII 限制酶切割點，故只有一個 DNA 片段：220 bp。若同時出現 220 bp、140 bp 與 80 bp 的 DNA 片段則為 Lys / Gln（野生變異型）。
1: XPD Lys / Lys（野生型）
2: XPD Lys / Gln（野生變異型）
3: XPD Gln / Gln（變異型）
M: Maker
V. hMLH1 promoter G to A
（1）Primer 序列
5'- AGTAGCCGCTTCAGGGA -3' 5'- CTCGTCCAGCCGCCGAATAA -3'
（2）PCR 反應溶液之配置 a. DNA 2 μl
b. hMLH1 primer 各 1 μl
c. 去氧核苷三磷酸（dNTP）5 μl d. Pro Taq buffer 5 μl
M 1 2 3
500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
220 bp 140 bp 80 bp
e. Taq 聚合酶（Taq polymerase）1 μl f. 最終體積以蒸餾水調製成 50 μl
（3）PCR 反應步驟
94℃、4 分鐘作為預變性，其次以 94℃、40 秒；55℃、30 秒；
72℃、40 秒的條件循環反應 35 次，最終設定 72℃、10 分鐘，使產物延 展更完全。之後在PCR 產物內加入 PvuII 限制酶、限制酶反應液及蒸餾 水，共20 μl，並置於 37℃水浴槽內 3 小時。再以 3％ agarose gel 進行電 泳分析。
聚合酶鏈鎖反應產物為 259 bp。hMLH1 G / G（野生型）兩條對偶 基因具有一個PvuII 限制酶切割點，故電泳結果有二個 DNA 片段，其長 度為134 bp 和 125 bp。若屬於 A / A（變異型），因兩個對偶基因不具有 PvuII 限制酶切割點，故只有一個 DNA 片段：259 bp。若同時出現 259 bp、
134 bp 與 125 bp 的 DNA 片段則為 G / A（野生變異型）。
1: hMLH1 G / G（野生型）
2: hMLH1 G / A（野生變異型）
3: hMLH1 A / A（變異型）
M: Maker
5. 彗星試驗 (comet assay) 或單細胞凝膠電泳法（single cell gel electrophoresis, SCGE）（40）
先取85 μl 1％ Normal melting point agarose（NMA）於 slide 上，蓋 玻片蓋上於室溫下固化（40 分鐘至一小時）【第一層膠】。取 4 ml 血液，
加入離心管與4 ml PBS 混合均勻，將混合液”緩慢”注入 Histropauqe 分離 液之分離管中，讓混和液分布在分離液上方。【注意：（1）混合液：
Histropauqe＝ 2：1。（2）滴入混合液時要沿著管壁緩慢的滴入，勿將混 500 bp
400 bp 300 bp 200 bp 100 bp
259 bp 134 bp 125 bp M 1 2 3
合液與分離液混合，否則分離的效果不佳。】。以 1800 rpm，離心 20 min (如果無明顯分層可再次離心)。離心結束後會分成三個色層，以滴管取出 中間層的lymphocytes 至另一離心管中，加入 PBS 至 4 ml 混合均勻，先 取出100 ul 計算細胞數再離心，倒出上清液後，把底層離心物打散，再 加PBS 至 4 ml，共清洗二次(1200 rpm，5 min)。每個樣本需要 5 ×
10
5個 細胞數，將最後離心的產物去除上清液，加入PBS 至 4 ml，取出實驗所 需的量至1.5 ml 避光褐色管。取下之前 NMA 的蓋玻片，待 slide 回溫，在避光褐色管加入 1 ml 1
％ Low melting point agarose（LMA）混合，取出 85 μl 於 slide 上，蓋上 蓋玻片於室溫下固化【第二層】（1％ LMA 溫度不可太燙，因須與細胞 混合，太燙會把細胞燙死(約 37℃)）。將slide 放入 Lysis buffer 浸泡，於 4℃
冰箱冷藏一小時【將細胞膜破裂】。將浸泡完的玻片用dd water 水洗（不 可讓玻片接觸空氣太久），再放入預先已放置電泳液的電泳槽浸泡20 分 鐘【電泳液呈鹼性，可使DNA unwinding】，而電泳槽須以鋁箔紙覆蓋避 光。電泳（條件：21 V；300 mA；15 min【電泳時間與 Tank 大小有關，
越大的Tank，所需電壓越大，時間越長】，並利用增加或減少電泳液來調 整伏特數與毫安培數到標準值）。【注意：上述步驟應避免照光，防止額 外的DNA 傷害（覆蓋鋁箔紙）】電泳結束以 dd water 水洗，浸泡 Tris buffer 15 分鐘來中和電泳液（室溫）。再以dd water 水洗，泡置於甲醇保存 10 min
【固定細胞】(可保存大約一個月)，取出後晾乾（完全乾），再滴上 40 μl 的PI（Propidium iodide）染色，置於螢光顯微鏡觀察。
以彗星尾巴拖曳長度與頭部中心之直徑比和或尾巴 DNA 佔總 DNA 含量比，將DNA 受損害程度分為 5 級（38）：
（1）無受損程度(no damage)：彗星尾巴 DNA 含量 ＜ 5％，核團大多 呈球型；
（2）低程度傷害(low level damage)：彗星尾巴 DNA 含量佔 5-20％，彗 星尾巴長度比頭部直徑短；
（3）中度傷害(medium level damage)：彗星尾巴 DNA 含量佔 20-40％，
尾巴長度略長於頭部直徑；
（4）高度傷害(high level damage)：彗星尾巴 DNA 含量佔 40-95％，尾 巴長度為頭部直徑2 倍以上；
（5）完全傷害(totel damage)：彗星尾巴 DNA 含量 ＞ 95％，幾乎看不 到彗星頭部。
【DNA 損傷積分計算】：個體之無傷害細胞數 × 0 + 低度傷害細胞數 × 1 + 中度傷害細胞數 × 2 + 高度傷害細胞數 × 3 + 完全傷害細胞數 × 4 = 個體DNA 損傷總積分（41）。