第三章 材料與方法
第三節 研究方法
一、 問卷調查
本研究為中國醫藥大學環境醫學研究所與台中縣和平鄉衛生所共同合作進 行。訪員經過教導訪視的技巧與痛風相關知識後，使訪員在問卷訪視過程能標準 化進行，進而深入和平鄉各部落為痛風個案及其家人進行衛教宣導。
本研究利用結構式問卷進行之，區分成病例版與對照版(附錄二、三)，個案 管理的痛風患者使用病例版(個案管理之追蹤問卷)，而對照組使用對照版。經過 受試者同意後，簽署受試者同意書(附錄四)，藉由當地公衛護士以面訪方式進行 問卷訪查。受試者接受身高、體重測量以計算其身體質量指數(body mass index，
BMI=體重(kg)/身高2(m2))，並請受測者採坐姿以量測血壓。病例版與對照版相同 的問卷內容包括個人基本資料(年齡、性別、種族、學歷..等)及疾病史(高血壓、
糖尿病、高血脂症..等);另外，病例版增加了病例組痛風家族史、痛風發作頻率 以及生活與飲食習慣(三個月內飲酒、飲食及運動狀況)的調查。病例組的問卷訪 視頻率為一年三次，對照組以一次訪視為主。
二、 生理及血液、生化檢查
研究對象簽署受試者同意書之後(附錄四)，同意接受身高、體重以及血壓測 量的生理檢查，以及由專業護士抽取受試者空腹靜脈血液樣本(約 10 ml)，包括 一般空白採血管之 5ml 一管，以及含有 EDTA 抗凝血劑之 5ml 一管，分別進行 生化値檢測與基因型鑑定分析。
一般血液生化檢驗包括空腹尿酸、肌酸酐、三酸甘油脂..等，藉由分離試管
採集血液樣本，並存放於4℃的冰桶內，送至和平鄉衛生所檢驗室進行離心的工 作，將血清分離出來，並在 24 小時內以自動分析儀(autoanalyser)將採集的血清 檢體進行分析檢驗; 而以 EDTA 採血管採集全血(whole blood)，以進行 DNA 的 萃取及基因型的檢測。所有收集到的血液樣本，運送全程均以4℃ 狀態保存。
三、 DNA 萃取
將所收集到的全血液樣本，在室溫之下以1500rpm 離心 15 分鐘，將含有白 血球細胞、血小板以及脂質的白血球衣(buffy coat)分離出來，分裝至 15 ㏄離心 管後加入4 ㏄的 RBC lysis buffer，並置於冰上 15 分鐘，中間每隔 5 分鐘以 vortex generator 振搖一次，以破壞、溶解紅血球細胞，接著再以 1200rpm 離心 15 分鐘，
將上液去除後留下底部的白血球細胞，再加入800μl Geno Maker 試劑來溶裂白血 球細胞，並放置室溫下3~5 分鐘。之後加入 500μl 的氯仿(chloroform)，混合均勻 後以 4 12000rpm℃ 離心 10 分鐘。小心吸取上清液至新的離心管中，再加入 isopropanol 600~800μl，上下搖晃而產生白色細絲。接著以 12000rpm 離心 5 分鐘 後，將上清液盡量去除留下底部沉澱物，再加入RNase cocktail 40μl 將半濕狀態 的沉澱物溶解後，靜置37 5℃ 分鐘，接著加入600μl ethanol precipitate buffer(約 97% ethanol)，混合均勻後，再以 12000rpm 離心 5 分鐘，再將上清液去除乾淨，
留下沉澱物並且晾乾2 小時，再加入 TE buffer 100μl，隔夜消化。完成後，以-20℃
冰箱保存DNA 檢體。以進行之後的 PCR 與 DNA 濃度(OD 值)的檢測。
四、 hURAT1 基因型鑑定
本研究以hURAT1 基因之兩種單一核苷酸基因多型性(SNP)進行分析，其一 為 hURAT1 基因中的第 258 個核苷酸由 C 變異成 T 的單一核苷酸多型性 (C258T)，位於第一個外子區域(表現序列，exon 1)上;而其次為第 426 個核苷酸也 是由 C 轉變成 T 的單一核苷酸的多型性(C426T)，位於第二外子(exon 2)的區域 內。本研究基因型的鑑定，參考Graessler 等人11研究中的引子(primer)序列以聚 合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)將帶有遺傳訊息的雙股螺旋 DNA 大 量 複 製 ， 再 藉 由 限 制 酶 片 段 長 度 多 型 性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)方法來進行基因型的鑑定。而為了再進一步確認基因型分 析結果，將隨機抽選DNA 擴增後的檢體，送至明欣生物科技公司(Mission Biotech Co., Ltd)進行基因體定序的工作(附錄五)。
A. Exon 1 C258T (rs3825016) (1) primer 序列
forward: 5’-CCT CAC GCG GCC TCA GGG CCC AGT T -3’
reverse : 5’-GGG TCC CTC CCA GGA CTG GAC CTT T -3’
(2) PCR 反應液的配置
a. DNA template (50 ng/μL) 1.5 μL b. 10X ProTaq Buffer 2.5 μL c. 去氧核苷三磷酸 (2.5 mM) 2.5 μL d. primer (10μM) 各 0.5 μL e. ProTaq polymerase (2 unit/μl) (Pro Tech) 0.5 μL f. 最終體積以滅菌蒸餾水(ddH2O)配置成 25μL
(3) PCR 反應步驟
將PCR 反應液配置好之後，採以熱啟動(hot start)的方式，待聚合酶 反應槽溫度到達90℃後，將配置好的 25μL PCR 反應液放入，並以 94℃
加熱5 分鐘使 DNA 雙股螺旋先進行預變性 (pre-denature step)，接著以高 溫94℃維持 30 秒使 DNA 雙股模板分離(denaturing)，再以 70℃維持 1 分 鐘使引子與單股模板作配對黏合(annealing)後，並再將溫度調整至 72℃進 行延長反應(extension)40 秒。由 94 40℃ 秒的條件至72 40℃ 秒的延長反應 (extension)為一週期反應，共重複進行 35 次週期反應。最後以 72℃再進 行延長反應6 分鐘後，以 4℃冷藏保存。產生的 724 base pairs(bp) PCR 產 物片段，藉以2% 溴化乙錠(EtBr)染色的瓊脂膠(agarose gel)維持 100V 2A 進行電泳分析、判斷。
(4) RFLP (BsrS I)
將PCR 方法所擴增的 724 bp 序列產物，取出 5μL 後，配合 NE buffer-D 0.6μL 與 BSA 0.1μL，並加入 0.3μL(共 3 units)的 BsrS I 限制酵素，以滅菌 後的蒸餾水配置最終體積為 10μL 的 RFLP 反應液。再將配置好的 RFLP 反應液放入65℃水浴槽中 3 小時，使其完全反應。最後以 2%瓊脂膠進行 電泳分析，並於紫外燈下照相觀察，其產生的片段如下圖所示。
lane1: CC type (20bp，223bp，464bp，17bp)
lane2: CT type (20bp，223bp，464bp，687bp，17bp) lane3: TT type (20bp，687bp，17bp)
lane4: negative control (NTC) lane5: 100 bp ladder marker
hURAT1 exon1 中 SNP C258T，經由限制酵素(BsrS 1)切割後產生 20bp，223bp，464bp，17bp 片段者為 CC 基因型，而產生 20bp，223bp，
464bp，687bp，17bp 片段者為 CT 基因型，若產生 20bp，687bp，17bp 者則判定為TT 型。
B. Exon 2 C426T (rs11231825) (1) primer 序列
forward: 5’-CCA ACC TCC TGA GCT CAG CCT CC -3’
reverse : 5’-CCA GTC GGC CAG GGT CCT AGG AGA GC -3’
(2) PCR 反應液的配置
a. DNA template (50 ng/μL) 2.0 μL 464 bp
223 bp
687 bp 700 bp
500 bp 200 bp 100 bp
b. 10X ProTaq Buffer 2.5 μL c. 去氧核苷三磷酸 (2.5 mM) 2.5 μL d. primer (10μM) 各 0.5 μL e. ProTaq polymerase (2 unit/μl) (Pro Tech) 0.5 μL f. 最終體積以滅菌蒸餾水(ddH2O)配置成 25μL
(3) PCR 反應步驟
將PCR 反應液配置好之後，採以熱啟動的方式，待聚合酶反應槽溫 度到達90℃後，將配置好的 25μL PCR 反應液放入，並以 94℃加熱 5 分 鐘，使DNA 雙股螺旋因熱變性而分離開來，接著以高溫 94℃維持 30 秒 使DNA 雙股模板分離，再以 69℃維持 40 秒使引子與單股模板作配對黏 合後，並再將溫度調整至72℃進行延長反應 30 秒。由 94 30℃ 秒的條件 至72℃ 30 秒的延長反應，稱為 cycle I，共重複進行 5 次的 cycle I。接著 再依據cycle I 的週期模式，改變配對黏合的溫度成 66℃，成為 cycle II，
並且重複進行25 次 cycle II。最後以 72℃進行延長反應 6 分鐘後，以 4℃
冷藏保存。產生的 214 bp PCR 產物片段，藉以 2% 溴化乙錠染色的瓊脂 膠維持100V 2A 進行電泳分析、判斷。
(4) RFLP (Nla III)
將 PCR 方法所擴增的 exon2 214 bp 序列產物，取出 5μL 後，加入 NE buffer-4 0.6μL 與 BSA 0.1μL，並加入 0.3μL(共 3 units)的 Nla III 限制酵 素，以滅菌後的蒸餾水配置最終體積為10μL 的 RFLP 反應液。再將配置 好的 RFLP 反應液放入 37℃水浴槽中 3 小時，使其完全反應。最後利用 8% polyacrylamide gels 進行電泳分析(90V, 500mA, 63min)，並以溴化乙錠
76 bp
外染染色後，置於紫外燈下照相觀察，其產生的片段如下圖所示。
lane1: 25 bp ladder marker lane2: negative control (NTC) lane3: CC type (138bp，76bp)
lane4: CT type (138bp，76bp，62bp，14bp) lane5: TT type (138bp，62bp，14bp)
hURAT1 exon2 中 SNP C426T，經由限制酵素(Nla III)切割後產生 138 bp 與 76 bp 片段者為 CC 基因型，而產生 138bp，76bp，62bp，14bp 片 段者為CT 型，若產生 138bp，62bp，14bp 者則判定為 TT 型。
第四節、 痛風個案管理紀錄
在本次研究中，衛生所公衛護士利用每次的痛風衛教與關懷前，對於痛風 個案管理成員於最近三個月內的飲食以及生活型態進行追蹤與紀錄，以及紀錄痛 風疼痛發作的情形。一年進行三次痛風衛教，平均衛教間隔時間約為三個月，並 且將資料透過「痛風個案管理卡」紀錄每次訪查的資料與個案指導管理的情形。
138 bp
62 bp
25 bp 50 bp 125 bp 150 bp
76 bp 75 bp
基本人口學相關資料的紀錄包括個案的性別、年齡、種族、教育程度與職 業，亦紀錄共病症及痛風發作頻率與初次急性痛風發作之相關資料。
飲食紀錄部分，調查個案三個月內常吃食物種類及攝取頻率。並了解痛風 個案的飲酒狀況及其工作勞動之情形。和平鄉痛風長期管理系統的各年度收案情 形如附錄六所示。
第五節、 統計方法
在所有資料取得之後，以Microsoft Office Excel 2003 進行資料的鍵入與彙 整，再藉由統計軟體SAS/PC 9.0 版進行資料的分析。
為了比較性別、年齡、種族等基本人口學資料在痛風組與對照組的分布情 況，則以Student’s t test 以及卡方檢定(χ2 test)進行分析。而在基因型方面，則利 用 適 合 度 檢 定(goodness of fit test)來檢定基因型的分布是否符合哈溫平衡 (Hardy-Weinberg Equilibrium)。然而，也利用了邏輯斯迴歸(logistic regression)探 討與痛風疾病的相關因子。在本研究中，藉由 log-rank test 以及 Willcoxon test 針對痛風患者(病例組)比較分層後初次疼痛發作年齡的分布情形，再以正比例涉 險模型(Cox’s proportional harzards model)進行與痛風初次疼痛發作年齡相關因子 之探討。
第六節、 使用試劑、儀器與材料
一、使用試劑 (1) DNA extraction
1. 1X RBC lysis buffer 2. GenoMaker reagent 3. Choloform
4. Isopropanol 5. RNase cocktail
6. Ethanol precipitate buffer 7. 99% Ethanol
8. TE buffer (2)PCR-RFLP
1. Agarose(Bio-M Bioscience；Promega, USA) 2. Ethidium Bromide (Amresco)
3. 2.5mM 去氧核苷三磷酸(dNTP) (Yeastern Biotech,Taiwan) 4. 10μM 核酸引子(Primer) (Mission Biotech,Taiwan)
5. 聚合酶(Taq) (Protech)
6. 10X 聚合酶緩衝液 (Protech)
7. BsrS I restriction enzyme (Promega, USA)
8. Nla III restriction enzyme (BioLab, New England)
9. BSA(bovine serum albumin) (Promega, USA；BioLab, New England) 10. 100bp Ladder (Protech)
11. 25bp Ladder (Promega, USA) 12. 1X & 5X TBE buffer (Amresco) 13. 40% Polyacrylamide (BIO-RAD)
14. 10% Ammonium Persulfate (APS) (AMRESCO) 15. TEMED (AMRESCO)
16. 6X Loading Dye (Protech ; Promega, USA)
二、使用儀器 1. 4 ℃ 冰箱
2. -20 & ℃ -85 ℃ 冰櫃 3. 恆溫水浴槽(FIRSTEK) 4. 聚合酶反應槽(EPPENDORF) 5. 水平電泳槽(GENEPURE) 6. 直立式電泳槽(BIO-RAD) 7. 柯達DCS260 紫外燈照相系統 8. 柯達影像分析軟體
9. 離心機
10. 烘箱(YIH DER)
11. 紫外燈分光光度儀 (BECKMAN，DU-500)
三、試驗材料 1. 石英比色管 2. Pipett
3. Tip（10ul、250ul、1000ul）
4. 塑膠滴管（3ml）
5. 微量離心管（1.5ml）
6. 離心管（15cc、50cc）
7. 8-strip（200ul）
8. 燒杯（100ml、1000ml）
9. 量筒（50ml、100ml）
10. 石臘膜
第四章、結果
第一節、痛風相關因子之探討
(一)、基本人口學變項之描述(表一)
依種族來分層探討痛風與基本人口學資料之關係。痛風患者平均年齡為56.2 歲，非痛風對象為 57.5 歲，兩者之間差異不具統計意義(p=0.584)。就本次的研 究對象上，男性在痛風族群中佔了較多比例(58.0%)，而於原住民(55.2%)以及非 原住民族群(62.8%)中也有著相同的現象。教育程度及職業在痛風組與非痛風組 之間分布並未有太大的差異，至於婚姻狀態部分，未婚、矜寡或者是單身者，在 痛風的族群中明顯比對照組有著較高的比例 (30.3% vs. 14.8%，p=0.024)。
(二)、痛風相關生理生化值(表二)
經由種族、性別及年齡的調整後，痛風患者比對照組有較高的尿酸濃度 ( 8.2 vs. 5.8 mg/dL，p<0.001) ，及肌酸酐(creatinine)的表現量(1.1 vs. 0.9 mg/dL，
p<0.001)。另外尿素氮(BUN)濃度及三酸甘油脂(TG)、身體質量指數(Body Mass Index, BMI)，痛風患者雖皆有較高的平均表現量，但統計上差異不顯著。
本研究之痛風病患中，有麩胺醯移轉酶(γ-GT)濃度較高的現象，但經由種 族、性別以及年齡的調整後，麩胺醯移轉酶與痛風之間則無顯著的相關。血壓方 面，痛風患者之舒張壓皆高於對照組，於調整性別、年齡後，非原住民的舒張壓 與痛風關係更為強烈(p=0.010)，但收縮壓與痛風的關聯性卻不顯著。
(三)、痛風相關之共病症(comorbid diseases)(表三)
在臨床上，痛風的產生時常伴隨著其他共病症的存在。因此，若依種族來
在臨床上，痛風的產生時常伴隨著其他共病症的存在。因此，若依種族來