2-1 螢光相關光譜
自從 1972 年 Magde D.等人開發出螢光相關光譜技術39後，此技術就常被應用於觀 察分子在水溶液中之運動行為，之後更應用於觀察細胞內酵素之動態行為。螢光相關光 譜發展至今已經三十多年，其技術上從一開始的自相關到後來發展了異相關，解析度也 配合光學解析度的技術增進，使得應用上更為廣闊，可以測量濃度、移動性、粒子尺寸、
結合 (binding)、體外 (in vitro) 與體內 (in vivo) 的實驗。螢光相關光譜非常適合觀察生 物體內動力學研究，目前應用範圍也非常的廣。
螢光相關光譜開發到現在已與許多技術結合，使螢光相關光譜在生物系統上的應用 更加多元：1993年將共軛焦系統與螢光相關光譜 (confocal-FCS) 結合，改善了實驗系統 靈 敏 度 與 減 低 背 景 雜 訊41。 1995 年 雙 光 子 螢 光 相 關 光 譜 (two-photon fluorescence correlation spectroscopy)42發明，雙光子激發光譜利用非線性光學原理，讓只在雷射聚焦 焦點處的螢光分子被激發，改善了在焦點處外的雜訊干擾。1997年單光子雙色螢光異相 關光譜 (one-photon dual-color cross-correlation spectroscopy)43 和2002年雙光子螢光異相 關光譜 (two-photon dual-color cross-correlation spectroscopy)44的研發，對於觀察分子之間 的動力學研究開啟另一個研究方向。掃描螢光相關光譜 (scanning-FCS)在1986年開始發 展45，藉由雷射光束掃描樣品或是樣品的移動使之通過雷射光束，觀察偵測體積內的螢 光強度擾動，與標準的螢光相關光譜相同，觀察相關函數的振幅可以推論螢光分子個 數。將相同的想法應用在影像相關光譜 (image correlation spectroscopy) ，影像相關光譜 在1993年被報導46，將原先是使用時間上的相關性，以空間區域間的相關性來換算。1981 年全反射螢光相關光譜 (TIR-FCS) 的發明47，對於光學的縱向解析度是一大躍進；由於
1977 年 Fahey P. F.等人首次使用螢光相關光譜觀察在脂質薄膜上的脂質側向移動 50。 1999 年 Jonas Korlac 等人使用螢光相關光譜與共軛焦掃描顯微鏡結合觀察脂雙層結構上 因為不同脂質與膽固醇，形成脂質雙層有區域的相分離狀態 51。在 1999 年由 Petra Schwille 等人發表在老鼠嗜鹼性白血球細胞上利用 DiIC-12 標定，利用螢光相關光譜測 量真實細胞膜的流動性52。2002 年 Kirsten Bacia 等人在霍亂病毒 AB 兩端各標定不同顏 色螢光染料，利用雙色螢光相關光譜觀察霍亂病毒在進入細胞內後，AB 兩端在細胞內 不同區域分離的情形53。1998 年 Ulrich Haupts 等人利用螢光相關光譜觀察綠色螢光蛋 白的螢光擾動54。1998 年 Ulrich Kettling 等人首次發表利用雙色異相關螢光相關光譜即 時的觀察酵素動力學行為55。2004 年 Kirsten Bacia 等人使用雙光子螢光相關光譜測量活 體器官上的腫瘤細胞外的物質，同時觀測分子尺寸不同的樣品在活體腫瘤細胞外含有玻 尿酸酶與膠原蛋白酶時的擴散係數表現，此項報導有助於了解研究藥物至腫瘤細胞間的 傳遞行為。2009 年 Christian Eggeling 等人將螢光相關光譜與受激發射損耗 (stimulated emission depletion, STED) 技術結合，觀察活體細胞膜上脂質更小區域的動力學行為，
為螢光相關光譜的技術推進更細微尺度的觀察56。利用自相關螢光相關光譜可觀察生物 體內的 pH 值變化、濃度變化、生物分子尺寸變化、環境黏致性和分子與細胞膜結合等，
利用異相關螢光相關光譜可觀察生物分子之間的結合或解離、酵素動力學和分子定位 (colocalization) 等。螢光相關光譜用來觀測細胞內的動力學是非常合適的工具。
螢光相關光譜技術利用高倍物鏡及共焦距小孔 (confocal pinhole) 形成的有限觀測 體積，觀察並紀錄螢光分子進出此雷射聚焦時造成的螢光訊號擾動。再利用硬體相關計 算器 (hardware correlator) 即時計算此時間變化 (time varying) 螢光訊號之自相關函數 (auto-correlation function)。若將隨時間變化的螢光強度表示為F(t)，自相關函數表示為
) (τ
G ，τ 為相關時間 (correlation time)，則自相關函數G(τ)可定義為57, 58
自相關函數可以有不同的表示法如下:
將式子(13)帶入式子(12)並簡化後可得當螢光分子在溶液中行布朗運動 (Brownian motion)，在一個有限觀測體積中進出所造成的螢光訊號變化之相關函數為
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Confined 2‐D diffusion
Diffusion time (τD)
Number density (N)D
Diffusion time (τD)
Number density (N)D
2-2 拉曼光譜
當光子與分子之間在碰撞的過程中發生了能量轉換導致散射光子頻率與波長發生 變化，這種散射稱為拉曼散射。雷射將分子的電子激發到一個虛擬能階 (virtual state) 之 後，電子自虛擬能階分別掉到不同振動能階上，反應出這個分子的不同振動能階資訊。
從拉曼光譜中可以得到分子振動能階，提供化學資訊，在測量時比較於紅外光光譜，水 的訊號干擾較小，所以拉曼光譜更適合應用在生物方面的測量59。
在本實驗中我們利用拉曼光譜技術決定脂質體在受到氧化物質的作用之後之結構 變化，並探討結構變化與膜流動性的變化之關係。實驗中我們利用雷射光鉗技術鉗住單 一脂質體60，並利用此雷射產生脂質體之拉曼散射觀察脂質分子受到氧化物質的影響之 結構變化。