背景介紹 - 利用螢光相關光譜與拉曼光譜技術探討活性氧化物質對脂質膜流動性與結構之影響

1-1 細胞膜流動性 1-1-1 細胞膜簡介

細胞膜是動物細胞最外層的結構¹。細胞膜的結構主要由脂質 (lipid) 組成，外加一些蛋白質與醣類。脂質主要由一個極性端接上兩條碳長鏈所構成，一般脂質碳鏈數量約為 14~24 個碳；細胞膜的性質可因脂質上碳鏈長短、極性端所接的官能基 (functional group) 和碳鏈飽和程度有所不同。細胞膜厚度大約 4-10 nm，主要由脂質長度所決定，

會因為脂質的排列情形和脂質中所嵌入的膽固醇含量使得細胞膜厚度有稍微變化 ²。在細胞膜上的脂質是以脂雙層 (lipid bilayer) 的形式排列，脂質的極性端朝外部，與水靠近。極性端的部分可分成：磷脂酸 (phosphatidic acid, PA)、磷脂醯膽鹼 (phosphatidyl choline, PC)、磷脂醯乙醇胺 (phosphatidyl ethanolamine, PE)、磷脂醯絲氨酸 (phosphatidyl serine, PS)、磷脂醯肌醇 (phosphatidyl inositol, PI) 與磷脂醯甘油 (phosphatidyl glcerol, PG)，其中有帶電荷的為磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇和磷脂醯甘油。在哺乳細胞的外層膜主要是由磷脂醯膽鹼、鞘磷脂 (sphingomyelin)、磷脂醯乙醇胺和膽固醇所構成，內層主要是由磷脂醯乙醇胺和磷脂醯絲氨酸構成，在正常生理 pH 值的情況下哺乳細胞的外層膜是呈現電中性；相對於哺乳細胞，細菌的外層膜則主要是有帶負電的磷脂質如磷脂醯甘油所構成³。

脂雙層中鉗入的蛋白質提供了細胞膜功能，例如通道 (channel)、受器 (receptor)和運輸 (transport) 等。細胞膜的功能很多，最基本功能就是隔離細胞質與細胞外的環境，

且形成一個可通透的膜層；細胞內與外在環境的能量、物質和訊息交換也是透過細胞膜控制^4-6。膜上的蛋白提供了細胞膜的功能，許多重要的生理過程例如細胞識別、細胞免

1-1-2 細胞膜流動性

細胞膜流體鑲嵌模型在 1972 年被提出⁹，對於後來人類思考細胞膜的組織、物質通透和細胞膜分子側向擴散性質是一個偉大的啟發⁷。

細胞膜的流動性是細胞膜的重要特徵，合適的流動性對生物膜表現正常功能具有十分重要的作用；許多細胞功能例如能量轉換、物質運送、信息傳遞、細胞分裂、細胞融合、胞吞、胞吐以及激素作用等都與細胞膜的流動性相關。維持適當的細胞膜流動性對於細胞來說是非常重要，例如巨噬細胞在吞噬外來物時，適當的膜流動性對於吞噬量是有幫助的；在正常膜流動速度範圍內，膜流動速度越快其吞噬效果越佳¹⁰。膜蛋白在膜上側向移動 (lateral diffusion)，與細胞分裂時能有適當的分離有關⁸。細胞膜流動性的快慢會影響膜蛋白的功能，當膜流動性改變可能會造成膜蛋白功能失效⁸。

細胞膜流動性的快慢可以分成兩個部分因素影響，一是外在因素，另一是細胞膜成分因素。外在如溫度增加會使膜流動性增快，壓力增加則使膜流動性變慢，脂質極性端造成的 pH 變化也會使流動性改變。細胞膜成分因素例如膽固醇、鞘磷脂、蛋白質與脂質比例、碳鏈飽和與不飽和比例和碳鏈長度，以上因素的增加都會造成流動性的變慢^{1, 11,}

12。膜流動性與細胞膜成分有極重要的關係，當細胞膜處於流動態時，碳數一樣的脂質，

不飽和鍵數量較多的脂質流動速度較快；而當不飽和鍵數量相同或是沒有不飽和鍵時，

碳數越短的脂質流動速度較快；碳數短比不飽和鍵增多造成的流動性改變較大。此外，

分子排列的緊密度也會影響細胞膜流動速度。

在生物系統中，維持細胞膜正常的流動性是維持脂質飽和與不飽和鍵的平衡。細胞膜流動性的快慢與其脂質成分有極大的關係，細胞膜在相轉變溫度之下時處於液晶態，

膜上的脂質排列整齊 (order)；但是當環境高於膜相轉變溫度時，細胞膜是處於流動態，

膜上的脂質排列較零亂 (disorder)。增加細胞膜上脂質的不飽和鍵數量與減短脂質的碳

1-2 活性氧化物質

1-2-1 活性氧化物質生成途徑

活性氧化物質 (reactive oxygen species, ROS) 是指含有氧分子，容易與其他物質發生反應的物質，其中含有自由基的活性氧化物質較容易造成生物體系統傷害。適當的活性氧化物質是細胞發揮正常功能所必需的，例如生物體內對付外來入侵物質、細胞間信息傳遞、精蟲的頂體反應和精卵結合細胞生長調節等。但是在活性氧化物質過量的情況下，生物體內的抗氧化基機制無法去除過多的活性氧化物質，將會造成細胞膜、DNA 和蛋白質的損傷，並且導致相關疾病發生。

活性氧化物質的生成可從外界與生物體內來區分，外界如 UV、酒精、輻射或藥物等都是生成活性氧化物質的來源，生物體則主要是從粒線體、酵素作用和金屬的催化反應為主要來源¹³。

在生物體中常見的活性氧化物質為超氧自由基 (superoxide, O^•₂⁻) 、過氧化氫 (hydrogen peroxide, H2O2) 和氫氧自由基 (hydroxyl radical, OH^y)。超氧自由基雖然有帶一個自由基，但是對於生物體的傷害卻不嚴重；超氧自由基在自然環境中很容易發生氧化還原，會和金屬離子反應，在生物體內也是生成過氧化氫的來源之一。過氧化氫屬於氧化劑，在生物體中過氧化氫是多種氧化物質的來源，和金屬離子反應則會生成氫氧自由基，和過氧化氫酶 (catalase) 反應形成水；只有在高濃度過氧化氫對細胞有傷害，在一般濃度下過氧化氫如果不與金屬離子反應，對於生物體的傷害是很小的。氫氧自由基含有不成對電子，半衰期短，是反應性極高的氧化物質。不成對電子容易從其他物質如脂質、DNA 或蛋白質搶走氫離子，造成結構改變；對於細胞膜，可能造成脂質過氧化甚至是造成膜上蛋白質與蛋白質交聯，使膜蛋白失去功能。氫氧自由基的半生期極短 (約 10^-8秒) ¹⁴，生成之後能夠擴散的範圍極小 (約 10 μm)，但是一旦被氫氧自由基接觸，則

1-2-2 活性氧化物質對流動性的影響

細胞膜是活性氧化物質反應的主要目標之一¹⁷，由於細胞膜上含有大量的不飽和脂質，容易受到氧化物質反應之後造成脂質過氧化；一旦發生了脂質過氧化之後，可能會減少不飽和鍵的含量或是產生丙二醛等副產物¹⁸，使脂質結構改變，進而影響細胞膜的流動性質。

在文獻上針對脂質過氧化後造成細胞膜流動性變化有許多不一致的結果。大多數提出的研究結果是加入氧化劑形成脂質過氧化後，造成流動性變慢^19-29，但是也有人提出在細胞膜在加入氧化劑之後流動速度會變快^30-32。有文獻提出在精蟲的不同部位做膜流動性的測量，發現不同部位受到氧化劑作用之後，其流動性的變化不一致³³。在文獻上決定細胞膜流動性的方法大多是利用電子自旋共振與螢光極化法，這些測量方法不是直接偵測細胞膜脂質的流動，而是利用細胞膜上的脂質之間排列緊密程度來推測細胞膜流動性質，可能是造成脂質過氧化後細胞膜流動性沒有一致結果的原因。

1-3 測量流動性方法介紹

測量細胞膜流動性的方法，目前文獻上使用下列幾種方法做為測量：螢光各向異性 (fluorescence anisotropy)、螢光極化法 (fluorescence polarization)、電子自旋共振 (electron spin resonance, ESR)、螢光漂白再恢復 (fluorescence recovery after photobleach, FRAP)、

單分子影像追蹤 (single particle tracking, SPT) 和螢光相關光譜 (fluorescence correlation spectroscopy, FCS)。我們將針對這幾種測量方式做簡單原理介紹：

1. 螢光各向異性和螢光極化法

螢光各向異性和螢光極化法通常使用染料 1,6-Diphenylhexatriene (DPH) 在膜上做標定。DPH 的結構是非極性、類似柱狀的對稱性，且由許多反式的烯類構成。DPH 會

2. 電子自旋共振

電子自旋共振是在膜上標定自旋脂肪酸偵測劑 (spin fatty acid probe)，常用的是 5-Doxyl-stearic acid (5-DS)或 12-Doxyl-stearic acid (12-DS)，這種偵測分子的特性為結構上有一碳長鏈，一端含有 NO 官能基；官能基上含有一個穩定自由基，使偵測分子在各 (recovery)。利用式子(4)去擬合 (fitting) 螢光漂白的區域 (region of interesting, ROI) 螢光隨時間的變化，得到整體擴散係數³⁶，得知細胞膜流動性³⁷。

4. 單分子影像追蹤

單分子影像是在膜上標定極少量的染料，利用高靈敏度的電荷耦合元件 (charge couple device, CCD) 記錄在短時間內螢光染料的影像，利用影像結果來追蹤染料在膜上的流動性質^{37, 38}。

入侵，更有可能會直接傷害細胞，造成細胞死亡。

(3) 無法觀察側向移動資訊：在細胞膜上蛋白質在膜上的移動膜是主要是側向移動，利用螢光極化性或電子自旋共振係觀察脂質分子的排列，得知膜的流動情形，無法觀測到膜側向移動的資訊。

(4) 容易受到生物自體螢光干擾：螢光相關光譜標定的極少染料螢光分子進出觀測體積造成的螢光擾動，而生物體本身的自體螢光可能會干擾判讀螢光染料分子擾動情形，造成結果上的誤差。

(5) 單分子影像是利用影像方法分析，由於影像紀錄需要一定的積分時間，在液晶態的膜流動速度比影像紀錄的時間還快，無法判斷在這個範圍內染料的移動路徑，所以單分子大多是應用在凝膠態的膜觀察，與真實細胞膜的流動形態不同。

1-4 脂質體

脂質體 (liposome) 1964 年被研究發表，之後常被利用作為研究細胞膜的模型。脂質體是以磷脂質構成，與細胞膜基本組成脂質類似，整體結構上也類似細胞膜是以脂雙層形式存在；細胞膜含有的物理特性在脂質體上都存在，例如膜流動性、通透性和相轉換等⁴⁰，所以脂質體常被使用做為細胞膜物理性質研究模型。

利用脂質體作為研究細胞膜的模型的優點在脂質體的成分單純。細胞膜組成除了脂質外還有蛋白質、醣類的存在，如果僅研究單純的細胞膜的單一性質，真實細胞膜研究可能會因為其他物質存在造成干擾。如果要探討結膜構變化，細胞膜上不同部位成分不

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