Fluorescence Correlation Spectroscopy GUV
Fluorescence Correlation Spectroscopy GUV
Fluorescence Correlation Spectroscopy GUV
1000 1500 2000
0.0
1000 1500 2000
0.0
3-1-1 藥品
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine (DOPC); Avanti Polar Lipids, U.S.A.
Cholesterol; Sigma Aldrich, U.S.A.
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate (DiD); Molecular Probes, U.S.A.
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI); Molecular Probes, U.S.A.
3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO); Molecular Probes, U.S.A.
Alexa Flour 633; Molecular Probes, U.S.A.
Glucose; Sigma Aldrich, U.S.A.
NaCl; Sigma Aldrich, U.S.A.
Choloform; J.T. Baker, U.S.A.
Methanol; J.T. Baker, U.S.A.
FeSO4•7H2O; Sigma Aldrich, U.S.A.
H2O2; Sigma Aldrich, U.S.A.
α-Tocopherol (vitamin E); Sigma Aldrich, U.S.A.
L-ascorbaic acid (vitamin C); Sigma Aldrich, U.S.A.
脂質、膽固醇和抗氧化劑結構如圖 3-2。
3-1-2 微脂體製備
本實驗所使用的脂質體做法使用電生成法 (electroformation)61，脂質體電生成法在 1986 年發明後，對於生成大尺寸的脂質體的方法有很大的進展，也是最常被利用來生成 大尺寸脂質體方法。脂質在使用前存放於攝氏-20 度，在使用前放到回到室溫在開啟使 用。脂質溶入氯仿/甲醇 (體積比 9/1) 的溶劑中 (5mg/mL) ，製作脂質體前先與染料混 合（拉曼實驗不加入染料），共軛焦掃描影像使用的染料濃度與脂質莫耳數比為 1 比 1000，螢光相關光譜使用染料濃度與脂質的莫耳數比為 1 比 100000。氧化銦錫 (indium tin oxide, ITO) 玻璃在使用之前以甲醇擦拭過後，分別在兩片氧化銦錫玻璃導電面上用 銅膜膠帶固定電線當作電傳導用，之後分別在兩片氧化銦錫玻璃導電面上各滴上 20 μL 脂質或脂質染料混合的溶液，使其均勻分布在氧化銦錫玻璃上；待其有機溶劑揮發之 後，讓氧化銦錫玻璃置於真空環境 1 小時。之後將氧化銦錫玻璃從真空環境取出後，在 氧化銦錫玻璃上放上 O 環 (O-ring) 當做間隔，在 O 環中加入 0.2 M 葡萄糖溶液，再將 兩片氧化銦錫玻璃上有脂質層的面對夾，使脂質都能與葡萄糖溶液接觸後，將電線接上 波型產生器 (function generator)。啟動波型產生器，並將參數調整為 10 赫茲、正弦波、
3 伏 (peak to peak)，通電三小時後取出脂質體溶液放入深褐色的小離心管中待實驗時使 用。製作流程見圖 3-3。
在膽固醇的實驗，將膽固醇分別與脂質的莫耳數比為 5%、10%、20%、25%、33%
和 50%（質量比為 2.5%、5.1%、10.9%、14%、19.4% 和 32.9%），在脂質體要溶解時 加入，一起製備成脂質體。
由於氧化銦錫玻璃在實驗後可能會有有機物或是髒汙殘留，為了避免這些髒污會影 響脂質體的生成或是環境，在每次要使用氧化銦錫玻璃前會依造下列清洗溶劑與浸泡時 間配合超音波清洗機清洗：
(1) 玻璃清潔劑 10 min；
3-1-3 氧化物質與抗氧化劑配法
在實驗中所使用的氧化物質有氫氧自由基 (OHy) 與過氧化氫 (H2O2) 兩種，反應持 續一個小時，在流動性的實驗觀察反應前與反應後流動性的差異，在結構上的變化則是 觀察隨時間變化。
過氧化氫的實驗在使用時將 35%（約 15.834 M）的過氧化氫稀釋成 3 mM，再取等 量體積的脂質體溶液與 0.1 M 氯化鈉溶液混合，過氧化氫最終濃度為 1 mM。
氫氧自由基的生成方法使用芬頓反應 (Fenton reaction)62，利用 Fe2+與 H2O2反應。
−
• +
+ +H O →Fe +OH +OH
Fe2 2 2 3 ( 16 ) 取等量體積脂質體溶液、0.15 mM 硫酸亞鐵、1.5 mM 過氧化氫混和可生成 0.05mM 的氫氧自由基。
在實驗中所使用的抗氧化劑有維他命 C 和維他命 E 兩種，反應持續一個小時，在流 動性的實驗觀察反應前與反應後流動性的差異，在結構上的變化則是觀察隨時間變化。
維他命 C 為水溶性的抗氧化劑，在實驗的時候先配成 4 mM 的維他命 C 溶液，與等 量體積的脂質體溶液先預混合後，在與等量體積的 0.2 mM 硫酸亞鐵、2 mM 過氧化氫 混合，維他命 C 最終濃度為 1 mM，氫氧自由基最終濃度為 0.05 mM。
維他命 E 為脂溶性的抗氧化劑，在實驗時須在脂質體生成時與脂質溶液先混合，再 利用電生成法生成脂質體。在生成脂質體時加入 0.25 mM 維他命 E，生成的脂質體取等 量體積脂質體溶液、0.15 mM 硫酸亞鐵、1.5 mM 過氧化氫混和，氫氧自由基最終濃度 為 0.05 mM。
實驗為求對照組的條件相同，所以過氧化氫、硫酸亞鐵、維他命 C 和維他命 E 在配 製與稀釋均使用 0.1 M 的氯化鈉溶液。
(a)
(b)
(c)
(d)
圖 3-2 藥品結構
ITO Lipids +
lipophilic dyes Glucose
Function generator 3 V, 10 Hz, 3 hr
Liposome + NaCl Vacuum
ITO Lipids +
lipophilic dyes Glucose
Function generator 3 V, 10 Hz, 3 hr Function generator
3 V, 10 Hz, 3 hr Function generator
3 V, 10 Hz, 3 hr
Liposome + NaCl Vacuum
圖 3-3 脂質體製作流程
脂質溶入氯仿/甲醇 (體積比 9/1) 的溶劑中 (5mg/mL)，製作脂質體前先與染料混合（拉 曼實驗不加入染料），共軛焦掃描影像使用的染料濃度與脂質莫耳數比 1:1000，螢光相 關光譜使用染料濃度與脂質莫耳數比 1:100000。之後分別在兩片氧化銦錫玻璃導電面上 各滴上 20 μL 脂質或脂質染料混合的溶液，使其均勻分布在氧化銦錫玻璃上；待其有機 溶劑揮發之後，讓氧化銦錫玻璃置於真空環境 1 小時。之後將氧化銦錫玻璃從真空環境 取出後，在氧化銦錫玻璃上放上 O 環當做間隔，在 O 環中加入 0.2 M 葡萄糖溶液，再 將兩片氧化銦錫玻璃上有脂質層的面對夾，使脂質都能與葡萄糖溶液接觸後，將電線接 上波型產生器。啟動波型產生器，並將參數調整為 10 赫茲、正弦波、3 伏 (peak to peak)，
通電三小時後取出脂質體溶液放入深褐色的小離心管中待實驗時使用。觀察的時候，取 20 μL 的脂質體溶液與 40 μL 氯化鈉溶液加進已黏上玻片的墊片中。
3-2 螢光相關光譜
3-2-1 螢光相關光譜系統架設
在實驗中所使用的螢光相關光譜系統為自行組裝之系統如圖 3-4。激發光是波長 632.8 nm 的氦氖雷射 (1137P; JDS Uniphase, U.S.A.)，利用 ND filter 去調整實驗所需要 的雷射功率 (laser power)；在螢光相關光譜系統中，雷射形狀需要形成高斯光束 (Gaussian beam) 激發，所以在光路上加上空間濾波器 (spatial filter)，一方面將雷射光束 放 大 ， 以 填 滿 物 鏡 的 背 面 孔 徑 (back aperture) 使 其 配 合 高 數 值 孔 徑 (numerical aperture，N.A.) 的物鏡達到最佳聚焦效果，另一方面空間濾波器可以只讓中間強度較均 勻的部分通過，使螢光可以均勻受光。雷射經過兩色濾光片 (dichroic mirror) (FF500/646;
Semrock, U.S.A.) 反射進顯微鏡，系統使用倒立式顯微鏡 (IX-71, inverted microscope;
Olympus, Japan)，雷射經過浸水式物鏡 (water immersion objective, UPLSAPO 60xW, N.A.
1.2; Olympus, Japan) 激發樣品後螢光延著物鏡往回到原光路上；螢光的波長較雷射光源 長，可穿過兩色濾光片。穿過兩色濾光片的光，再經過透鏡聚焦，而聚焦前螢光會通過 分光鏡 (50/50 beam splitter) 讓螢光均勻分成兩道之後，同時通過適當波段的濾光片 (HQ680/60m; Chroma, U.S.A.) 以蒐集最大量的螢光，再聚焦到共焦針孔上，我們以孔徑 50 μm 取代共焦針孔，目的是為了以營造一個有限的偵測體積，再導入偵測器；在這理 使用雪崩光電二極管 (Avalanched photodiode, SPCM-AQR-15-FC; PerkinElmer, U.S.A.) 做為偵測器，光子訊號會轉為電子脈衝訊號，電子訊號再傳送到時間相關單光子計數器 (Flex02-01D; Correlator, U.S.A.)，再利用時間相關單光子計數器計算出螢光分子的相關 情形。雷射與所使用的光學組件與染料光譜見圖 3-5。
3-2-2 系統校正方法
系統校正時使用 1nM 的螢光染料 Alexa Fluor 633（溶在 PBS 溶液，擴散係數為 1.35
×10-10 m2/s）63。理想的螢光相關光譜系統參數決定於聚焦處體積 (focal volume) 的 r/z 值，理想的值約在 0.17~0.33。在系統的校正上，會先利用移動平台調整光纖收光的位置，
粗調到螢光最強的位置後，在細調光纖 z 方向的位置。找到螢光值都沒有太大變化之後 就微調物鏡的修正環 (correction ring)。螢光相關光譜對於玻片的厚度非常地靈敏，所以 要得到最佳系統參數必須要將修正環作細調，調整到可以得到最佳參數的位置。在做系 統調整的時候曾經遇到過 r/z 值為極小 (< 0.0001)，參考文獻後試過下列方法作調整5： (1) 調整空間濾波器 (spatial filter) 的針孔 (pinhole) 位置：調整針孔的位置使其針孔能
發揮最佳功能，針孔位置位於光束聚焦點前會導致光通過的量過少，位於光束聚焦 點後面則會因光已經發散而沒有效果，準確位於光束聚焦點才能使針孔效果最佳。
(2) 調整空間濾波器的透鏡 (lens) 位置，確定光束是平行 (collimator)：因所使用的物鏡 需要平行光源才有最佳的聚焦效果。
(3) 更換空間濾波器的透鏡，使光束的大小改變：我們會在空間濾波器之後放一個 IRIS 來調整光通過的量的大小，如果經過了空間濾波器後光束放大那可以只選擇中間品 質較好的光通過。
(4) 調整進入顯微鏡前雷射光束的大小：進入物鏡的雷射光束大小會影響在利用物鏡聚 焦之後光束的形狀，而在文獻上有提到進入物鏡前的雷射雙束在單光子 (single photon) 螢光相關光譜只需比物鏡背面孔徑小一點 (under filled)，而在雙光子 (two photon) 螢光相關光譜則需大於物鏡背面孔徑 (over filled)。
(5) 更換收光前聚焦的透鏡：因收光的部分是利用光纖代替針孔 (pinhole)，所以螢光光 束在經透鏡聚焦時形成的的角度須與光纖配合，利用焦距較短的透鏡會讓聚焦光束
纖的孔徑太小。
3-2-3 實驗步驟
脂質體在測量時，先將中間有直徑 25 mm 孔洞的墊片 (chamber: FW-9; Grace Bio-Labs) 與玻片 (cover glass: Electron Microscopy Science) 黏貼後，加入 0.1 M 40 μL 氯化鈉溶液，再加入脂質體溶液 20 μL。利用脂質體內外密度與折射率不同，脂質體會 沉到玻片上且可以清楚看見脂質體的輪廓。因為要模擬真實細胞大小，所以在實驗時所 挑選測量的脂質體的大小選擇在 20~30 μm；測量時雷射功率約為 47 μW，每顆脂質體 測量 10 次，每次 10 秒，10 次的數據取平均後則為此顆脂質體的數據。在尋找膜的位置，
配合使用電動移動平台移動脂質體；測量所使用的軟體為 flex02-01C，隨時間相關單光 子計數器 (correlator) 所附軟體。
因為下層膜會受到玻片的影響，所以在實驗中都是觀察上層膜的訊號。先在亮視野 (bright field) 下將脂質體的中心移到雷射光束聚焦的點上，之後切換顯微鏡的轉盤使雷 射進入，讓雷射在上層脂質膜聚焦，之後利用光子數和粒子數與擴散時間 (diffusion time) 來決定膜的位置。延著光行進的方向（縱軸）對不同位置的脂質體做掃描，從圖 3-6 的 結果得知：當找到正確膜的位置會得到 (1) 光子數最高；(2) 粒子數最少（即螢光相關 函數曲線的振幅 (amplitude) 最大，相關值最大）；(3) 擴散時間 (diffusion time) 最短64。
在分析經螢光相關光譜所得到的數據時，利用以下三個原則決定這組數據是否可使 用：(1) 起始 count rate 至少大於 10000 counts；(2) 只取 count rate 大於 3000 counts 的數 據；(3) 10 次的測量其標準差 (standard deviation) 在 10%內，符合以上三個條件此顆脂 質體的結果才使用。
實驗測量結果將利用
1
1 1 ) (
−
⎥⎦
⎢ ⎤
⎣
⎡ +
= N D
G τ
τ τ 做擬合 (fitting)。每次做實驗前先測量系統
r2
APD
60X Water N.A. 1.2
Laser 632.8 nm
Correlator APD
60X Water N.A. 1.2
Laser 632.8 nm
Correlator Correlator
圖 3-4 螢光相關光譜系統架構圖
激發光是波長 632.8 nm 的氦氖雷射 (1137P; JDS Uniphase, U.S.A.)，雷射形狀需要形成 高斯光束 (Gaussian beam) 激發，所以在光路上加上空間濾波器 (spatial filter)，一方 面將雷射光束放大，以填滿物鏡的背面孔徑 (back aperture) 使其配合高數值孔徑 (numerical aperture，N.A.) 的物鏡達到最佳聚焦效果，另一方面空間濾波器可以只讓
激發光是波長 632.8 nm 的氦氖雷射 (1137P; JDS Uniphase, U.S.A.)，雷射形狀需要形成 高斯光束 (Gaussian beam) 激發，所以在光路上加上空間濾波器 (spatial filter)，一方 面將雷射光束放大，以填滿物鏡的背面孔徑 (back aperture) 使其配合高數值孔徑 (numerical aperture，N.A.) 的物鏡達到最佳聚焦效果，另一方面空間濾波器可以只讓