4-1 脂質體之基本鑑定
在此研究工作我利用電生成法製備脂質體。為能對同一個脂質體進行長時間觀察，
我在製備脂質體時加入 0.2 M 葡萄糖溶液；觀察的時候，溶液再加入 0.1 M 氯化鈉溶液，
使脂質體內溶液的密度大於脂質體外溶液的密度。這時大多數的脂質體會下沉到玻片表 面，維持靜止，且因為脂質體內外溶液的折射率不同，可以明顯觀察脂質的輪廓。
以下我將討論脂質體基本鑑定的實驗結果：
首先我利用雷射共軛焦掃描顯微鏡 (laser confocal scanning microscopy) 觀察脂質 體的形貌。為了利用螢光成像方法觀察脂質體，我在電生成法製備脂質體時加入少量類 脂質染料 DiO (DOPC 與 DiO 之莫耳數比為 1000 比 1) 做螢光標定。圖 4-1(a)是脂質體 之共軛焦螢光影像，圖 4-1(b)則是在同時間取得之亮場 (bright field) 影像。圖 4-1 的結 果顯示電生成法可成功的製備單一雙層 (single bilayer) 的脂質體，而直徑大多在 20 至 30 μm 之間。這個尺寸的脂質體非常適合應用於螢光相關光譜技術測量膜的流動性。
為了應用螢光相關光譜技術測量膜的流動性，我在 DOPC 脂質膜上標定更少量的類 脂質染料 DiD (DOPC 與 DiD 之莫耳數比為 100000 比 1)，再利用自行架設的螢光相關 光譜系統配合電動移動平台，做脂質體橫向與縱向掃描。圖 4-2 是脂質體隨著電動移動 平台的移動，螢光強度的變化，橫向掃描為每步 0.1 μm，縱向掃描為每步 0.2 μm。從圖 4-2 的結果可知，不論是做橫向或是縱向的掃描，最強的螢光強度只出現在脂質體膜的 位置，可確定染料只標定在脂質上。將圖 4-2 分別對橫向與縱向掃描的螢光強度峰用高 斯函數 (Gaussian function) 做擬合 (fitting)，從最佳擬合函數之半高寬可得到實驗系統 的橫向解析度達 0.3 μm，而縱向解析度達 1.1 μm。此結果反映出我的實驗系統已調整到
如圖 4-3 所示。從圖 4-3 的結果顯示只有在雷射準確聚焦在膜的位置時可得到最大的相 關值 (amplitude 最大)。這是由於當雷射焦距與膜重合時，偵測範圍最小，偵測到的分 子數也最少，因此可得到最大的螢光擾動。
求得偵測範圍內的螢光分子數目 N (number of molecule) 與相關時間 (correlation time)
或有時稱為擴散時間 τD (diffusion time) 值。決定 τD 值後，再利用
(lipids)；k 1653 cm-1: C=C stretch (lipids)；l 1740 cm-1: C=O stretch。在之後的實驗我們 將利用 1440 cm-1的強度做均一化之後，觀察 1653 cm-1的 C=C 在加入氧化物質前後強度 變化，並以此訊號之變化代表脂質的氧化程度；我們也將未對 1440 cm-1均一化的光譜，
觀察 1440 cm-1與 1653 cm-1隨時間的強度變化。
接下來將利用螢光相關光譜測量 DOPC 脂質體膜的流動性，並利用拉曼光鉗系統測 量 DOPC 脂質體的分子結構變化，並探討不同氧化物質、抗氧化劑和膽固醇這些因素對 於流動性與結構變化的影響。
(a)
(b)
圖 4-1 利用電生成法所製備脂質體之顯微影像
圖 4-1(a)是共軛焦掃描影像，圖 4-1(b)是同時取得之亮場 (bright field) 影像；由圖之結 果顯示，利用電生成法製備的脂質體之直徑大多在 20 μm 上下。Scale bar = 20 μm。
0 10000 20000 30000 40000
Displacement / μm
Count rate (counts/s)
0 10 20 30 40
Count rate (counts/s)
Displacement / μm
Liposome Liposome 0.3μm
1.13 μm
0 10000 20000 30000 40000
0 10 20 30 40
Displacement / μm
Count rate (counts/s)
0 10 20 30 40
Count rate (counts/s)
Displacement / μm
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0 2 4 6 8 10
+0.8 μm
+0.4 μm
0 μm
-0.4 μm
Delay time / s
-0.8 μm
Time / s
Displacement
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0 2 4 6 8 10
+0.8 μm
+0.4 μm
0 μm
-0.4 μm
Delay time / s
-0.8 μm
Time / s
Displacement
圖 4-3 在不同聚焦深度對脂質體進行螢光強度及螢光相關光譜量測的結果
圖右為螢光強度隨時間的變化，圖左為對應之螢光相關光譜函數。由圖之結果顯示，當 雷射聚焦在膜上時 (以黑色線表示)，螢光相關光譜的相關值最大。
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 0
1 2 3 4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Number of molecules
Displacement / μ m
D / 10
-8cm
2/s
圖 4-4 在不同聚焦深度對脂質體做螢光相關光譜測量結果
圖中黑色實心點為不同深度所測量到的擴散係數，灰色空心點為不同深度所測量到的平 均螢光分子數量。結果顯示當雷射聚焦在脂質體膜上將測到最少螢光分子數與最大擴散 係數值。
10
-510
-410
-310
-210
-110
0750 1000 1250 1500 1750 2000
750 1000 1250 1500 1750 2000
0.0
d 877 cm-1: C-C-N+ symmetric stretching (lipids) e 1064 cm-1: skeletal C-C stretch of lipids
f 1083 cm-1: C-N stretching
4-2 不同氧化物質的影響
在生物體內的活性氧化物質中，過氧化氫和氫氧自由基屬於常見的兩種。過氧化氫 與金屬離子或酵素反應形成其它活性氧化物質，而氫氧自由基在生物體內主要由過氧化 氫與金屬離子反應生成。接下來我們將觀察過氧化氫和氫氧自由基是否會對脂質體 DOPC 膜流動性與結構造成改變，並且探討流動性改變與結構改變之間的關係。
我們在脂質體 DOPC 中加入 0.05 mM 氫氧自由基和 1 mM 過氧化氫，反應一小時之 後，利用螢光相關光譜測量反應前後染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動的擴散時間。圖 4-6 是脂質體 DOPC 加入 0.05 mM 氫氧自由基和 1 mM 過氧化氫反應前後染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到的螢光自相關曲線，且相關值已做均一化的處理。從圖 4-7 的結 果顯示加入氫氧自由基的脂質體 DOPC，其染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到的擴 散時間明顯較未加入之前短，而加入過氧化氫其染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到 的擴散時間與未加入之前比較無差異。
利用二維移動式子擬合得到擴散時間，代入
diff
D r τ 4
2
= 0 得到擴散係數，將多次測量
結果做統計，統計結果如圖 4-8 與表 4-1 所示。結果顯示未加入氧化物質前的染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到的平均擴散係數為 6.52±0.33×10-8 cm2/s (n = 29)，加入氫氧 自由基的染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到的平均擴散係數為 10.59±2.67×10-8 cm2/s (n = 31)，相較於未加入氫氧自由基之前的脂質體 DOPC，染料分子 DiD 在 DOPC 膜上 運動得到的擴散係數有顯著變大，反映脂質體 DOPC 膜流動速度有顯著的增快 (P = 5.87×10-8)；加入過氧化氫的染料分子 DiD 在 DOPC 膜上運動得到的平均擴散係數為 6.49
±0.62×10-8 cm2/s (n = 12)，相較於未加入過氧化氫之前的脂質體 DOPC，染料分子 DiD
鐘測量到的光譜平均，第 10 分鐘係指 6~10 分鐘測量到的光譜平均，依此類推；每個時 間的光譜均扣除背景值後強度對 1440 cm-1均一化處理。從圖 4-9 結果可以看出在未加入 氧化物質前與加入過氧化氫後，1653 cm-1的強度沒有明顯的變化，但是加入了氫氧自由 基後則有隨時間強度下降的趨勢。圖 4-10 是用圖 4-9 處理方式再取多筆數據平均統計的 結果。統計的結果顯示，加入氫氧自由基 60 分鐘後脂質的 C=C 雙鍵強度下降約 15% (P
= 0.004)，但是加入過氧化氫 60 分鐘後雙鍵強度並無顯著差異 (P = 0.3)。從拉曼光譜的 結果推論脂質體 DOPC 的 C=C 有受到氫氧自由基破壞，但是不受過氧化氫影響。在文 獻上有人提出在活性氧化物質中，氫氧自由基會造成脂質過氧化，而過氧化氫不會，而 我們也測量到氫氧自由基的確造成了流動性與結構變化。接下來我們將對流動性與結構 變化提出解釋。
圖 4-11 是未加入氧化物質的脂質體與加入氫氧自由基或過氧化氫的脂質體未做過 均一化處理的拉曼光譜，將每個時間光譜除以第 0 分鐘光譜，觀察脂質體 DOPC 1440 cm-1 (-CH2) 與 1653 cm-1 (C=C) 隨著時間的強度變化。圖 4-11 的結果顯示未加入氧化 物質前的脂質體其單鍵與雙鍵之強度隨著時間幾乎沒有變化；加入氫氧自由基的脂質體 其單鍵與雙鍵之強度隨著時間都有下降，加入氫氧自由基一小時後單鍵強度約下降 10%，雙鍵強度約下降 25%；加入過氧化氫的脂質體其單鍵強度隨著時間幾乎沒有變化，
雙鍵強度在加入過氧化氫一小時後約下降 10%。
從螢光相關光譜得到的結果是氫氧自由基造成脂質體 DOPC 膜流動性增快，過氧化 氫則沒有造成膜流動速度變化；從拉曼光譜得到的結果是加入氫氧自由基後脂質體 DOPC 的雙鍵強度有隨時間下降，但是加入過氧化氫卻沒有，且氫氧自由基加入也會造 成脂質體 DOPC 的單鍵破壞。從結構變化與流動性變化的結果推論：脂質體 DOPC 在 氫氧自由基的加入後，會影響結構的變化，造成雙鍵與單鍵的破壞，但是碳鏈變短使脂 質體 DOPC 的流動性增快，我們將利用圖 4-12 來說明脂質過氧化機制。
在靠近極性端，也有可能是接在碳長鏈上的那端。
文獻上提到，較短的碳鏈和雙鍵數量的增加都能夠增加膜的流動性，但是在兩個條 件皆存在下，碳鏈較短的脂質流動速度會比含有雙鍵的脂質更快。拉曼結果顯示脂質體 加入氫氧自由基後，碳鏈雙鍵與單鍵皆有破壞情形，但是脂質體碳鏈變短影響流動速度 較大，所以在脂質體受到氫氧自由基的攻擊之下可以得到流動性增快的情形。
在進行加入氫氧自由基的實驗時，發現在玻片底部有脂質碎片的形成。從圖 4-12 提出的機制推論有可能是因為氫氧自由基加入造成脂質體 DOPC 碳鏈變短，碳鏈變短讓 脂質體結構不穩定，有些脂質體會破裂，所以形成碎片。為了鑑定這些碎片是否真的是 脂質體 DOPC 的碎片，我們在脂質體上標定濃度較高的染料，且加入濃度更高的氫氧自 由基 (0.1 mM)，做長時間的共軛焦掃描影像觀察。圖 4-13 是在不同時間的共軛焦掃描 影像結果，結果顯示隨著加入氫氧自由基的時間增長，在玻片底部的碎片越來越多，由 於染料只會標定在脂質上，所以可以確認這些碎片都是脂質碎片。從圖 4-13 的結果印 證我們所提出的機制：脂質體加入氫氧自由基會造成碳鏈變短，讓脂質體結構不穩定，
有些脂質體會破裂，所以形成碎片。
我們利用了螢光相關光譜與拉曼光譜測量了氧化物質對於脂質體 DOPC 流動性與 結構上的變化，同時利用結構變化的結果來解釋流動性的改變；我們得到的結果是氫氧 自由基會造成脂質碳鏈的變短，促使流動性增快，而過氧化氫則沒有影響脂質體的流動 性與結構。接下來將利用螢光相關光譜與拉曼光譜繼續研究抗氧化劑與膽固醇如何影響 脂質過氧化後流動性與結構變化。
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Control
G(τ)
Delay time / s
OH• treated
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Control
G(τ)
Delay time / s
H2O2 treated
圖 4-7 不同氧化物質對膜流動性之影響
左圖中黑色及灰色線分別為未加氫氧自由基之控制組與加入氫氧自由基 0.05 mM 之實 驗組的結果。右圖黑色及灰色線分別為未加氫氧自由基之控制組與過氧化氫 1 mM 實驗
左圖中黑色及灰色線分別為未加氫氧自由基之控制組與加入氫氧自由基 0.05 mM 之實 驗組的結果。右圖黑色及灰色線分別為未加氫氧自由基之控制組與過氧化氫 1 mM 實驗