的樹突細胞在氣喘動物模式中的預防與治 療的效果
3.2 研究方法與材料 .1 小鼠來源 .1 小鼠來源
六至八週大的雌性BALB/c 小鼠，由台大醫學院實驗動物中心與 國家動物中心購入，於台北醫學大學動物房明邦生物科技公司代養。
3.2.2 過敏氣喘動物模式的建立
可作為過敏氣喘的過敏原有卵清蛋白 (Ovalbumin,OVA)、蟑螂蛋 白與塵蟎蛋白 (house dust mite)，在本實驗選用可誘發較高對抗原專 一性抗體IgE 的 Balb/c 小鼠，使用常用的 OVA 作為過敏原來建立過
敏氣喘動物模式。將過敏原 OVA 與鋁佐劑一起混勻後注射到小鼠腹
腔內，引發對OVA 有專一性的抗體。在此 OVA 誘發的氣喘動物模式 上可以觀察到 (1) 血清中對過敏原有專一性的 IgE 與 IgG1 上升而 IgG2a 量低。(2) 呼吸道有過度收縮反應的情形，(3) 肺部有嗜酸性血 白球與嗜中性白血球較多聚集的現象，(4) 肺沖洗液中 Th2 細胞數量 增加。
3.2.3 評估 Ad-IL-10/IL-12 感染的樹突細胞用來預防或治療氣療動 物的效果
（一）預防小鼠過敏氣喘實驗
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實驗流程於Fig.8 表示，在實驗開始的前七天將攜帶有不同基因 腺病毒載體所感染的樹突細胞 (5×10
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cells/mouse)注射到小鼠氣管內，在第零天、十天時對BALB/c 小鼠給予腹腔注射 OVA 抗原 (50 μg/mouse)，以 4 mg/mouse 的鋁佐劑混合成溶液，注射 200 μl/mouse。
於並在第零天、七天、十四天會進行眼窩採血，將血液經12000 rpm 離心5 分鐘兩次，收集血清並保存於-20℃，以進行之後的 anti-OVA 抗體分析。在第十二天開始連續兩天鼻腔給於OVA 抗原 (250 μg/ml，
40 μl/mouse) 、之後連續三天給予小鼠吸入性抗原 5% OVA 刺激。於 第十七天偵測呼吸道阻力的變化，第十八天犧牲小鼠採血與收集肺沖 洗液來進行細胞分析、測量肺沖洗液中細胞激素及發炎介質的分泌量，
及取全肺作肺組織切片染色。
3.2.3.1 實驗分組 將老鼠分成四組：
第一組為對照組 (PC)：給予未感染腺病毒載體的樹突細胞。
第二組為Ad-Mock 組：給予 Ad-Mock 腺病毒載體 (MOI 500) 感染的 樹突細胞。
第三組為Ad-IL-10/IL-12 組：給予 Ad-IL-10 (MOI 500) 及 Ad-IL-12 (MOI 5000)腺病毒載體感染的樹突細胞。
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第四組為naive 組：即未給予任何的樹突細胞注射。
（二）治療小鼠過敏氣喘實驗
實驗流程於Fig.18 表示，在第零天、十四天、二十八天與第三十 五天時對BALB/c 小鼠給予腹腔注射 OVA 抗原 (50 μg/mouse)，以 4 mg/mouse alum 佐劑混合成溶液，注射 200 μl/mouse。在第零天、十 四天、二十八天與第三十五天進行眼窩採血，將血液以12000 rpm 離 心5 分鐘兩次，以收集血清並保存在-20℃，以進行之後的 anti-OVA 抗體分析。在第二十八天將腺病毒載體感染的樹突細胞 (5×10
5
cells/mouse)注射到小鼠氣管內，在第三十八天開始連續兩天鼻腔給於 OVA 抗原 (250 μg/ml，40 μl/mouse) 、之後連續三天給予小鼠吸入性 抗原5% OVA 刺激。於第四十三天偵測呼吸道阻力的變化，第四十四 天犧牲小鼠採血與收集肺沖洗液來進行細胞分析、測量肺沖洗液中細 胞激素及發炎介質的分泌量，及取全肺作肺組織切片染色。3.2.3.2 實驗分組 將老鼠分成六組：
第一組為對照組 (PC)：給予未感染腺病毒載體的樹突細胞。
第二組為Ad-Mock 組：給予 Ad-Mock 腺病毒載體 (MOI=500) 感染 的樹突細胞。
第三組為Ad-IL-10 組：給予 Ad-IL-10 腺病毒載體 (MOI=500) 感染
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的樹突細胞。
第四組為Ad-IL-12 組：給予 Ad-IL-12 腺病毒載體 (MOI=5000) 感染 的樹突細胞。
第五組為Ad-IL-10/IL-12 組：合併給予 Ad-IL-10 (MOI=500) 及 Ad-IL-12 (MOI=5000) 腺病毒載體感染的樹突細胞。
第六組為naive 組：即未給予任何的樹突細胞注射。
3.2.4 對 OVA 專一性的血清抗體測定
取動物模式中不同時間點分別進行眼窩採血所收集得之血清，測 量anti-OVA 之 IgE、IgG1 及 IgG2a 的抗體效價。首先將含有 OVA 的 緩衝溶液注入96 孔盤中，置於 4℃隔夜，隔天用 1× PBS -Tween 20 洗劑沖洗後拍乾，然後注入填充緩衝液3 % BSA/ 1× PBS 於室溫下靜 置兩小時，再用1× PBS -Tween 20 洗劑沖洗，之後加入已稀釋的待 測血清100 μl/well，置於 4℃冰箱中放置整晚，隔天用 1× PBS -Tween 20 洗劑沖洗，再加入 100 μl/well 的 biotin-conjugated-anti-mouse IgE、
biotin-conjugated-anti-mouse IgG1、biotin-conjugated-anti-mouse IgG2a 於室溫靜置45 分鐘後，用 1× PBS -Tween 20 洗劑沖洗。加入
streptavidin-HRP 100 μl/well，於室溫靜置 30 分鐘後，用 1× PBS -Tween 20 洗劑沖洗，之後加入 100 μl/well 的 ABTS 呈色，待呈色後 加入5 % SDS 溶液終止呈色反應，以 ELISA Reader 測量 O.D.
405 nm
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吸光值。為方便每次實驗結果之比對，以本實驗製作之標準血清 (standard serum)，測得的 O.D.值定為 1 ELISA unit (1 E.U.)。
3.2.5 呼吸道阻力測試
此為採用非侵入性的測試方法，使小鼠在意識清楚下可進行重覆 不同時間點的呼吸道阻力變化測試。利用系統中的transducer 及 preamplifier 收集小鼠呼吸道變化的訊息而計算出 Penh 值，Penh 值的 計算方式為Pause × PIF；Pause = (Te-Tr)/Tr (PIF: peak inspiratory flow；PEF：peak expiratory flow；Te：expiratory time；Tr：relaxtion time)。
刺激呼吸道收縮的方式為小鼠一開始先接受生理食鹽水的刺激，之後 再依序增加methacholine 的濃度，每個濃度刺激三分鐘後即記錄小鼠 三分鐘的呼吸道生理變化。數據表示以每個不同濃度時間點所得到的 Penh 平均值除以每隻小鼠只吸入生理食鹽水後所得的 Penh 值，可得 到Penh 相對增加的比例，以 relative increase ratio