61
在近代治療的過敏氣喘的許多方法中，減敏療法與固醇類藥物為 目前臨床使用上常見的兩種。目前許多科學家皆積極致力於從病源根 本下手開發新的治療方法，在最常被討論的基因療法中，我們選擇了 使用腺病毒來當作我們的載體，送入IL-10 與 IL-12 基因形成
Ad-IL-10/Ad-IL-12 感染樹突細胞，使樹突細胞能夠大量表現 IL-10 與 IL-12 細胞激素，再藉由這些修飾的樹突細胞應用到細胞實驗或氣喘
動物實驗來探討調節T 細胞分化與其是否能調節體內的過敏氣喘免
疫反應。
在細胞實驗的結果中，給予合併不同劑量的Ad-IL-10/IL-12 能夠 誘發CD4
+
T 細胞形成特殊的 T 細胞群，分泌產生高量的 IL-10 與 IFN-γ，並藉由細胞與細胞的接觸來抑制作用型 T 細胞的增生。將此 群修飾的樹突細胞應用在氣喘動物模式的實驗中，在實驗前給予 Ad-IL-10/IL-12 感染之樹突細胞，可以預防呼吸道阻力的增加，肺部 發炎細胞浸潤與發炎趨化物質的產生。其作用是藉由誘發體內產生高 量的IL-10 與 IFN-γ來達到有效減低並預防過敏氣喘Th2反應的發生。而在更進一步的實驗中，我們比較單獨與合併給予 Ad-IL-10/IL-12 在 已患有過敏氣喘的小鼠上治療的結果，從呼吸道阻力降低、肺部發炎 情形減緩與脾臟細胞培養的實驗結果中皆發現Ad-IL-10/IL-12 同樣也 可以應用在治療已發病的過敏氣喘症狀上。
62
為了更加證實這個預防的效果的確是經由所給予Ad-IL-10/IL-12 樹突細胞所執行產生的，我們將此群樹突細胞經由尾靜脈注射的方式 注射到動物體內，經一段時間後取出CD4
+
T 細胞利用細胞質內染分 析細胞激素表現，同樣也發現到Ad-IL-10/Ad-IL-12 感染的樹突細胞 在動物體內可誘發一群表現IL-10 與 IFN-γ的 CD4+
T 細胞。經由這些結果我們認為給予合併的Ad-IL-10/IL-12 不論應用在細 胞或動物實驗上，的確可以誘發一群高量表現IL-10 與 IFN-γ的特殊 CD4
+
T 細胞，且藉由此群特殊的 CD4+
T 細胞可以抑制動物體內與過 敏氣喘反應有關的Th2 細胞增生。之後若能將合併的 Ad-IL-10/IL-12 應用在臨床或免疫療法上，期許也能看到同樣有效的預防與治療效 果。63
圖 (Figure)
64
65
Ad-IL-10/IL-12 Ad-IL-12 Ad-IL-10 Ad-Mock PC CD 80 CD 86 MHC II M CD 1 1 c
22.93 % 21.96 % 53.42 % 51.35 %
20.92 % 51.47 %
41.73 % 78.27 % 76.16 %
38.72 % 62.12 % 67.21 % 62.90 % 93.96 % 93.39 % 34.26 % 37.94 % 32.84 % 34.55 % 35.74 %
66
Fig.2 感染腺病毒載體之樹突細胞表現細胞表面抗原的情形
從骨髓取出細胞培養成樹突細胞後，在培養的第六天加入不同種 類的腺病毒載體感染樹突細胞，48 小時後收取樹突細胞利用流式細 胞儀分析細胞CD 80、CD 86、CD 11c 與 MHC class II 的表現分子表 現情形。
67
1:10 1:20 1:40 1:80
0
1:10 1:20 1:40 1:80
0
1:10 1:20 1:40 1:80
75
68
69
OVA323-339 (ug/ml) cpm (x103 )
OVA
323-339(ug/ml)
IL -1 0 (n g /m l)
OVA323-339 (ug/ml)
IFN-γ (pg/ml)
70
1:1 1/2:1 1/4:1 0:1
150 200 250 300
350 PC
Ad-Mock Ad-IL-10 Ad-IL-12 Ad-IL-10/IL-12
** **
**
Tr : Te c p m ( x10 3 )
Fig. 6 各 T 細胞群影響作用 T 細胞增生的情形
將培養出的T 細胞群(Tr)再與 CD4+ T 細胞(Te)、γ-irradiated APC
及OVA
323-339
一起作用培養72 小時後，加入 1 μ Ci/well 的3
H-thymidine作用16~18 小時後，收集細胞分析作用 T 細胞增生的情形。實驗數據 與各組0:1 (Tr : Te) 比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p<
0.05，** p< 0.01。
71
0 10 20 30 40 50 60
1:1 (transwell/anti-IL-10R Ab) 1:1 ( + transwell) 1:1( +anti-IL-10R Ab) 1:1( +control Ab) Tr : Te (1:1) Tr : Te (0:1)
**
cpm (x10
3)
Ts : T e
Fig. 7 以 transwell 分隔 CD4
+
T 細胞群來觀察影響作用型 T 細胞增生的情形
利用 transwell 將培養兩個循環的 CD4
+
T 細胞與作用型 T 細胞分 隔開，將CD4+
T 細胞 (2.5×105
cells/well)置於上層的 transwell，作用 型T 細胞 (2.5×105
cells/well)置於 24 孔細胞培養盤中，加入γ-irradiated APC 及 OVA323-339
一起作用培養 72 小時後，加入 1 μ Ci/well 的3
H 作 用16~18 小時後，收集細胞分析作用 T 細胞增生的情形。72
Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
2 4
6
***
IFN-γ+ IL-10+ CD4+ (%)
Fig. 8 小鼠經尾靜脈注射感染腺病毒載體之樹突細胞後分析脾臟內 CD4
+
T 細胞表現細胞激素變化情形實驗第零天經由Balb/c 小鼠尾靜脈給予感染腺病毒載體之樹突 細胞(1×10
6
cells/mouse)，第十三天犧牲小鼠取其脾臟細胞加入 OVA 培養72 小時後利用細胞質內染分析脾臟細胞中 CD4+
T 細胞表現 IFN-γ與 IL-10 細胞激素的變化情形。實驗數據為 N=2 的平均值，與 Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。
IFN-γ IL-10
Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12
73
i.t. DCs i.p. i.p. i.n. inhalation AHR sacrify
Day-7 0 7 10 12 13 14 15 16 17 18
Fig.9 氣喘小鼠動物模式之建立及利用腺病毒載體感染之樹突細胞
來預防過敏氣喘之流程
在實驗開始的前七天經由呼吸道給予樹突細胞(5×10
5
cells/mouse)，於第零天與第十天分別給予腹腔注射過敏原 OVA (50 μg/mouse 與 OVA 100 μg/mouse)。在第零天、七天、十四天與第十八 天則進行眼窩採血，收集血清保存於-20℃。之後在第十二天與第十 三天經由鼻腔給予OVA (100 μg/mouse)，第十四天開始連續三天給予
霧化的OVA 過敏原刺激，於第十七天進行呼吸道阻力的測試，隔天
犧牲小鼠做各項檢測。
bleed bleed bleed bleed
74
Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。
A.
B.
C.
75
re la ti ve i n cr ease r a ti o
Fig. 11 預防過敏氣喘動物模式中呼吸道阻力變化
實驗的第十七天測小鼠吸入不同濃度的methacholine 對於呼吸道 過度反應的影響。先讓老鼠吸入0.9 %的 NaCl 霧化溶液三分鐘後，
再記錄之後三分鐘呼吸的變化，得出基準值的Penh 值(baseline)，之 後再依序給予不同濃度6.25、12.5、25、50 與 100 mg/ml 的 methacholine 作用三分鐘，並各別記錄呼吸情形的變化，與基準值相比較後，就可 得到呼吸情形相對增加的比例。實驗數據與Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p<
0.001。
76 Macr
op hag e
Eosi no ph il
N eu tr op hi l Lymp
ho cyte 0
100 200 300
PC
Ad-Mock
**
***
Ad-IL-10/IL-12
3 cell n u m b er (x 1 0 ) **
Fig. 12 預防過敏氣喘動物模式中肺沖洗液中的細胞分佈情形
為分析肺部發炎細胞的組成分佈，經由氣管插入1 ml 針筒，利 用1 ml HBSS 反覆沖洗肺部後收集肺沖洗液，利用 Liu’s 染色法染細 胞後，在顯微鏡下觀察細胞型態，將其分為四類並計算各別細胞的數 量。實驗數據與Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示 方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。
77
A. B.
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
78
A. B.
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
25 50 75 100
125
eotaxin
eotaxin (pg/ml)
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
25 50 75 100
125
KC *
KC (pg/ml)
Fig. 14 預防過敏氣喘動物模式中肺沖洗液中發炎物質的變化情形
利用ELISA 分析肺沖洗液中趨化嗜酸性白血球 eotaxin 和趨化嗜 中性白血球KC 發炎物質的含量，實驗數據與 Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p<
0.001。
79
(stimulatory index)值。實驗數據與 Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。
A.
B.
C.
80
A. B.
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
25 50
IL-4
IL-4 (pg/ml)
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
PC Ad-Mock Ad-IL-10/IL-12 0
81
A.
B.
Fig. 17 預防過敏氣喘動物模式中胸部附近的淋巴細胞分泌細胞激素 的變化情形
將胸部附近取出的淋巴細胞培養於50 μg/ml OVA 的環境中 48~72 小時後收取細胞上清液，利用 ELISA 測量細胞激素 IFN-γ及 IL-10 的含量。實驗數據與 Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢 定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。
82
(A）PC (B) Ad-Mock
(C) Ad-IL-10/IL-12 (D) naive
Fig. 18 肺組織切片的染色結果
老鼠犧牲後取下全部的肺葉保存於10 %的福馬林溶液中，以石 蠟包埋後切片，再以hematoxylin-eosin 染色後在顯微鏡下用 400x 觀 察肺部的病理變化。(A)正對照 (PC)組 (B) Ad-Mock 組 (C)
Ad-IL-10/IL-12 組 (D) naive 組
83
i.t. DCs
i.p. i.p. i.p. i.p. i.n. inhalation AHR
Day
0 14 28 35 38 39 40~42 43 44bleed bleed bleed bleed sacrify
Fig.19 利用腺病毒載體感染之樹突細胞來治療過敏氣喘動物之流程
在實驗的第零天、十四天、二十八天與第三十五天時，給予 BALB/c 小鼠腹腔注射 OVA 過敏原(50 μg/mouse)。在第零天、十四天、
二十八天與第三十五天則進行眼窩採血，收集血清保存於-20℃。直 到第二十八天時才將有腺病毒載體感染的樹突細胞(5×10
5
cells/mouse) 注射到小鼠氣管內，於第三十八天開始連續兩天鼻腔給予OVA (250 μg/ml，40 μl/mouse)，之後連續三天給予小鼠霧化的 OVA 刺激，於 第四十三天偵測呼吸道阻力的變化，隔天犧牲小鼠採血並做各項檢 測。84
re la ti ve i n cr ease r a ti o
Fig. 20 治療過敏氣喘動物模式中呼吸道阻力的變化情形
實驗的第四十三天測吸入不同濃度的methacholine 對於小鼠呼吸 道阻力增加的情形。先讓老鼠吸入0.9 %的 NaCl 霧化溶液三分鐘後，
再記錄之後三分鐘的呼吸變化，得出基準值的Penh 值(baseline)，之 後再依序給予不同濃度6.25、12.5、25、50 與 100 mg/ml 的 methacholine 作用三分鐘，並各別記錄呼吸情形的變化，與基準值相比較後，就可 得到呼吸情形相對增加的比例。實驗數據與Ad-Mock 組比較，以 student’s t test 進行檢定，表示方式為* p< 0.05，** p< 0.01，*** p<
0.001。
85 cell n u m b er ( x 1 0 4 )
Fig. 21 治療過敏氣喘動物模式中肺沖洗液中的細胞分佈情形