先用10 % FBS-DMEM 培養液培養 AD-293 細胞株，大量培養至
直徑15 公分的培養皿、生長密度為八分滿後，吸出培養液，重新加
入2 % FBS-DMEM 與種子病毒培養約 26-30 個小時，待感染情況約 有50-70 %的細胞漂起後，用培養液將細胞沖下收集至離心管，離心 1500 rpm、10 分鐘後，收集底部的細胞保存於-80℃以做後續病毒純 化。在病毒純化的方面，將收集好的細胞用 1× PBS 回溶，在液態氮 與37℃水浴槽中反覆快速的冷凍解凍三次，用 4℃離心 3000 rpm、15 分鐘後留上清液做密度梯度純化。準備三種密度（1.25 g/cm
3
、1.33 g/cm3
、1.40 g/cm3
）的CsCl 溶於二次水中備用。在超高速離心管中由 底部依序加入1.40 g/cm3
及 1.25 g/cm3
的CsCl，再加入離心收集到的 病毒上清液，在4℃離心 47500 rpm、2 小時後，腺病毒顆粒會集中在 1.25 g/cm3
與1.44 g/cm3
中間形成灰白色的環狀懸浮，將此灰白色環 狀懸浮收集起來，準備做第二次的純化。在第二次的純化中，先將第 一次所收集下來的灰白色環狀懸浮加入超高速離心管中，剩下的體積 用1.33 g/cm3
的 CsCl 補滿後，以 4℃離心 47500 rpm、18 小時後，再 一次收集灰白色的環狀懸浮液體。為了純化所得到的腺病毒溶液，使 用透析溶液 （0.1 M Tris、10 mM MgCl2
及10 % glycerol）去除多餘26
的鹽類與水分後即可保存於-80℃。
2.2.2 培養樹突細胞
將6~8 週以上的 BALB/c 雌鼠犧牲後，取下脛骨與股骨後將肌肉 剔除乾淨，用70 %酒精浸泡後用 HBSS 將酒精洗去。剪開骨蓋與骨 頭後將骨髓沖出，之後將收集大塊的骨髓細胞以 10 ml 針筒沖散，用 1500 rpm，4℃離心 10 分鐘倒掉上清液，以 ACK lysis 溶液將紅血球 分解，再加入HBSS 以中和 ACK lysis 溶液後離心去上清液，之後用 10 ml 的 HBSS 回溶細胞、離心，重覆 2~3 次以洗去多餘的 ACK lysis 溶液。計算細胞數調成2×10
6
cells/well，加入 GM-CSF (500 unit/ml) 與IL-4 (1000 unit/ml)，以 5 % FBS-RPMI-1640 培養液培養於 24 孔 細胞培養皿中，為第0 天。在第 2 天時補充培養液與等量含 GM-CSF 與IL-4 的細胞激素，第 4 天時將細胞沖起後收集細胞並離心，換新 的培養液並加入等量GM-CSF、 IL-4 與 OVA peptide323-339
(1 μg/ml) 再種到新的24 孔培養皿中。第 6 天將懸浮細胞吸起，重新計算細胞 數成5×105
cells/well，加入等量 GM-CSF、 IL-4 與 OVA peptide323-339
， 依實驗設計給予不同組別與不同劑量的腺病毒載體Ad-Mock、Ad-IL-10 以及 Ad-IL-12 來感染樹突細胞，48 小時後 (第 8 天)收集細 胞用於後續的實驗。
27
2.2.3 分析腺病毒感染之樹突細胞細胞表面分子的變化
在第八天的被腺病毒感染之樹突細胞收集後離心去上清液，用1
× PBS 洗去多餘的培養液後，加入 (1) PE-conjugated-anti-CD 80 (B7.1) Ab、FITC-conjugated-anti-CD 86 (B7.2) Ab 與 (2)
FITC-conjugated-anti-CD 11c Ab、PE-conjugated-anti-MHC II Ab 各 1 μl，
於4℃作用 30 分鐘後再用 FAC 緩衝溶液 (含 1 % FBS 的 1× PBS) 2 ml 離心1500 rpm，10 分鐘以洗淨細胞，重覆兩次後即可以流式細胞儀 (flowcytometry)分析細胞的表面分子。
2.2.4 純化 CD4
+
T 細胞取6 週以上的基因轉殖小鼠 DO11.10 之脾臟，將之磨細成脾臟細 胞後，吸取液體置於離心管中靜置5 分鐘後吸取懸浮液在 4℃、1500 rpm 離心 10 分鐘後去掉上清液，細胞以 ACK lysis 溶液作用將紅血球 細胞分解，再加入HBSS 在 4℃、1500 rpm 離心 10 分鐘，再以 HBSS 洗去多餘的ACK lysis 溶液 2~3 次。計算好脾臟細胞的細胞數後加入 MACS 緩衝溶液回溶脾臟細胞 (1×10
7
cells/ 90 μl)與帶有磁珠的 CD4+
抗體 (1×107
cells/ 10 μl) 與細胞在 4℃作用 15 分鐘後，加入 1 ml /1×107
cells 的 MACS 緩衝溶液在 4℃、1500 rpm 離心 10 分鐘洗去多 餘的磁珠。離心後將上清液吸乾淨並拍散細胞，加入0.5 ml/1×108
cells28
的MACS 緩衝溶液回溶細胞，準備純化細胞。MACS 緩衝溶液潤溼 純化管柱，待緩衝溶液滴乾後後加入回溶的細胞以純化，滴乾後接著 用MACS 緩衝溶液沖洗純化管柱，重覆三次。第三次滴乾後取下純 化管柱置於離心管上，加入MACS 緩衝溶液將細胞沖出，離心管中 的細胞即為CD4
+
T 細胞。2.2.5 培養 T 細胞群
將攜帶有腺病毒載體的樹突細胞 (4×10
5
cells/well)與 CD4+
T 細 胞 (1×106
cells/well)加入 OVA-peptide323-339
(1 μg/ml)與 T 細胞生長因 子IL-2 (2 ng/ml)以 10 % FBS-RPMI-1640 培養液共同培養在 24 孔細 胞培養皿中，為第0 天。第 3 天吸取 0.1 ml 的細胞上清液保存於-20℃用以做之後的細胞激素測定。其間每 2-3 天觀察培養液顏色以加入 新鮮的培養液維持足夠細胞生長的養份。培養7~10 天為一個循環，
之後再置入新的腺病毒感染樹突細胞共同培養為第2 個循環，經過 3 個循環的重覆刺激可培養出一群特定的T 細胞群。
2.2.6 樹突細胞刺激 T 細胞分裂增生能力實驗
將CD4
+
T 細胞(2×105
cells/well)與不同比例攜帶腺病毒載體的樹 突細胞 (2×104
、1×104
、0.5×104
、0.25×104
cells/well)以 2 %FBS-RPMI-1640 培養液共同培養在 96 孔細胞培養皿中，72 小時後收
29
集細胞上清液做之後的細胞激素測定，並加入1 μ Ci 的
3
H-thymidine 培養16~18 小時，以細胞收集器 (automated multi-sample harvester)收 集細胞至玻璃纖維濾膜 (glass filter)，待膜烘乾後，以放射線計量器 (dry scintillation counter)計算放射線的量，用以作為分析 T 細胞分裂 增生情形，數據直接以c.p.m.值表示。2.2.7 T 細胞增生實驗
將刺激兩個循環後的特殊T 細胞群 (2×10
5
cells/well)加入不同劑 量OVA-peptide323-339
( 0、1、2、4 μg/ml )，觀察增生情形是否隨著加 入過敏原的濃度增加而提高，培養方式以10 % FBS-RPMI-1640 培養 液共同培養在96 孔細胞培養皿中，72 小時後收集細胞上清液做後續 的細胞激素測定，並加入1 μ Ci 的3
H-thymidine 培養 16~18 小時，以 細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾膜，待膜烘乾後，以放射線計量器 計算放射線的量，數據直接以c.p.m.值表示。2.2.8 抑制 T 細胞群增生實驗
取6 週以上的基因轉殖小鼠 DO 11.10 之脾臟細胞，以 MACS 分 離出CD4
+
細胞與 CD4－ 細胞。CD4－ 細胞以 γ 射線照射 3000 rad 使 細胞不再分裂作為抗原呈獻細胞 (1×105
cells/well)，與之前所培養出 的特殊的T 細胞群 (做不同比例組：1×105
、0.5×104
、0.25×105
、030
cells/well)和作用型 CD4
+
T 細胞一起培養在 96 孔細胞培養皿中，加 入OVA-peptide323-339
( 1 μg/ml )刺激 48~72 小時，收集細胞上清液做 之後的細胞激素測定，並加入1 μ Ci的3
H-thymidine 培養 16~18 小時，以細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾膜，待膜烘乾後，以放射線計量 器計算放射線的量，數據以c.p.m.值表示。
2.2.9 利用細胞質內染分析特殊 T 細胞群所表現的細胞激素
CD
4 +
T 細胞與腺病毒感染的樹突細胞共同培養兩個循環後，在 24 孔細胞培養盤中加入此群特殊的 T 細胞群 1×106
cells/well，在 20 μg/ml 的 PMA 與 1 mg/ml 的 ionomycin 置於 37℃作用 2 小時後，加 入5 mg/ml 的 Brefeldin A 繼續作用 4 小時。之後將細胞全部收集置於 eppendorff 中於 4℃，1500 rpm 離心 5 分鐘，去掉上清液，接著加入 100 μl 的 staining buffer 回溶細胞。於 isotype 控制組則加入 isotype control 的抗體，並於各樣本管加入 CD4+
抗體混均後置於4℃避光作 用1 個小時。1 小時後加入 100 μl 的 fixation buffer 於室溫避光靜置 20 分鐘，再加入 100 μl 的 premeabilization buffer 輕輕震盪均勻，於 4℃，1500 rpm 離心 5 分鐘，離心後小心吸掉上層 200 μl 的上清液，
加入100 μl 的 premeabilization buffer 再次輕輕震盪均勻，於 4℃，1500 rpm 離心 5 分鐘後去掉上層 200 μl 的上清液。之後就依需求加入所要
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染的抗體。
加入anti-IFN-γ與 anti-IL-10 抗體，於 4℃避光靜置 30 分鐘，加 入100 μl 的 premeabilization buffer 輕輕震盪均勻，於 4℃，1500 rpm 離心5 分鐘，吸取 100 μl 的上清液，加入 200 μl 的 staining buffer 回 溶細胞，利用流式細胞儀分析細胞內表現細胞激素的情形。
2.2.10 利用 transwell 分析特殊 T 細胞群抑制作用的特性
在24 孔細胞培養盤中，利用 transwell 隔開細胞與細胞間的接觸，
於下層的24 孔培養盤中加入作用型 CD
4 +
T 細胞與抗原呈獻細胞，上 層的transwell 中加入特殊 T 細胞群與抗原呈獻細胞，加入過敏原 OVA-peptide323-339
(1 μg/ml)刺激 72 小時後，將 24 孔培養盤中的細胞，轉移到96 孔培養盤中，並加入 1 μ Ci 的
3
H-thymidine 培養 16~18 小 時，以細胞收集器收集細胞至玻璃纖維濾膜，待膜烘乾後，以放射線 計量器計算放射線的量，數據以c.p.m.值表示。2.2.12 統計方法
採用unpaired student’s t test 來進行生物統計檢定，在 * p< 0.05 時表示兩組間有顯著差異，而在 ** p< 0.01 時則代表兩組間有非常顯 著之差異。