本研究採用之動物模式有兩種：（一）以門靜脈結紮造成肝外門
脈高壓動物模式及（ニ）以膽管結紮造成肝內門脈高壓動物模式。所 有動物實驗過程皆按照美國生理學學會之實驗動物照顧及使用指引 原則來進行。
一、門靜脈結紮造成肝外門脈高壓動物模式（第一組）
雄性 Sprague-Dawley 大白鼠在接受手術時之體重為 400–450 公 克。大白鼠置於 24°C 的環境中，亮暗週期各 12 小時，在實驗前均可 自由進食及飲水。門靜脈結紮之方法如下：以 ketamine HCl 輔以乙 醚將大白鼠麻醉，在無菌狀況下於腹壁縱向切開。將大網膜和部分腸 道輕輕撥出腹腔之外，並以和暖之 lactated Ringer 溶液濕潤的紗布保 持潮濕。在分離出肝動脈及總膽管之後，將門靜脈曝露出來。以一磨 鈍之 20 號針頭平行地貼近肝門靜脈，再以 3-O 絲線於靠近靜脈分枝 上處將門靜脈及針頭一起結紮，然後將針頭取出，使門靜脈稍作擴張 起來。最後將腹部臟器置回腹腔，以縫線及金屬夾將腹壁各層縫合起 來，再以抗生素藥膏塗抹傷口，靜待動物慢慢恢復意識後再置回籠中
﹝114﹞。在手術後 2 週所有大白鼠皆產生門脈高壓及側枝循環，此 時再度剖腹切下一葉肝臟，並立即置入液態氮中，貯存在−70°C 直至 抽取其中之 RNA。
二、以膽管結紮造成肝內門脈高壓動物模式（第二組）
雄性 Sprague-Dawley 大白鼠在接受手術時之體重為 300–350 公 克。大白鼠置於 24°C 的環境中，亮暗週期各 12 小時，在實驗前均可 自由進食及飲水。膽管結紮之方法如下：以 ketamine HCl 輔以乙醚
將大白鼠麻醉，在腹壁縱向切開，以上述方法將大網膜和部分腸道輕 輕撥出腹腔之外，然後分離出總膽管，以 4-O 絲線沿總膽管上下兩處 予以結紮。上方結紮位置為靠近肝內膽管分枝處，下方結紮位置為靠 近胰管與總膽管交接處；然後從中切下約 10 mm 長的總膽管（115），
再以上述方式縫合及上處理傷口，靜待動物慢慢恢復意識後再置回籠 中。為防止動物發生凝血機能缺失，在術後每週皆予肌肉注射 50 µg/kg 之維生素 K1。在手術後 6 週再度剖腹切下一葉肝臟，並立即置 入液態氮中，貯存在−70°C 直至抽取其中之 RNA。
三、對照組（第三組）
雄性 Sprague-Dawley 大白鼠在接受「假裝手術」（sham operation）
時之體重為 300–350 公克。大白鼠置於 24°C 的環境中，亮暗週期各 12 小時，在實驗前均可自由進食及飲水。手術方式除了不進行總膽 管結紮及切斷外，其餘處理過程如以膽管結紮造成肝內門脈高壓動物 模式。術後不予維生素 K1，在手術後 6 週再度剖腹切下一葉肝臟，
並立即置入液態氮中，貯存在−70°C 直至抽取其中之 RNA。
第二節 肝臟組織 RNA 的萃取 一、RNA 的萃取
本實驗抽取 RNA 之主要試劑為 PRotch Technology 公司生產的 RezolTM C ＆ T (PRotch Technology) 試 劑 。 其 原 理 修 正 自 Acid Guandinium Thiocyanate- phenol-chloroform 快速萃取 RNA 的方法。
將裝有肝臟組織的 eppendorf 封上 parafilm，置於裝有工業用乙醇和 乾冰的容器內反應 20-30 分鐘後，取出組織於研缽磨碎，再加入 2 ml RezolTM C＆T (PRotch Technology)試劑。將組織 lysate 轉置於圓底離
約 15 秒，再於室溫下靜置 2 分鐘。然後再在 4°C 中 12000 x g 轉速離 心 15 分鐘，取出上清液至新的圓底離心管中，加等容積的 isopropanol
（Merck）混合均勻，室溫下靜置 10 分鐘後 4°C 中 12000 x g 轉速離 心 10 分鐘，將離心後上清液倒掉，加 1 ml 之 75％ 乙醇，輕微地以 vortex 混合然後，在 4°C 以 12000 x g 轉速離心 5 分鐘。倒掉上清液 後，將 RNA 乾燥後，溶於 100 µl 滅菌二次水，分裝成 30 µl、30 µl、
20 µ l、10 µl、10 µl，存於 -70°C 冰箱中直至進行反轉錄聚合 連鎖J 反應（reverse transcription-PCR, RT-PCR）。
二、吸光值 (OD 值) 之測量
為測定萃取標本中 RNA 之含量，將溶於滅菌二次水的 RNA 混 合後，在 65°C 乾浴 5 分鐘，然後置於冰上，再次 mix 後取出 1 µl 並 加 99 µl 之滅菌二次水於新的 eppendorf 中。另取 100 µl 滅菌二次水 當 blank，利用 Backmen spectrophotometer DU 650測量。以波長 260 nm 測量 RNA 的吸光值及波長 280 nm 測量蛋白質的吸光值，若 RNA 的 吸光值與蛋白質的吸光值之比值在 1.8 至 2.0 之間，則符合實驗所需。
三、Agarose 電泳
為測定萃取物中 RNA 之純度，將 RNA 萃取液電泳跑膠。首先 將跑膠的模板、齒模、tank 以 AbSolveTM (伯森生物科技) 擦拭過；
取 1 g 的 Agarose，加入 100 ml 的 1X TAE buffer (10X TAE: 400 mM Tris-acetate，20 mM EDAT)，加熱溶解，在膠凝固前加入適量 ethedium bromide 後倒入模板中並放入齒模，待其冷卻凝固後即可使用。將 1%
的膠放入電泳槽中，加入 1X TAE buffer，以 100 伏特電壓進行電泳 30 分鐘之後觀察是否有 DNA 之雜質及 RNA 的存在以符合實驗所需。
第三節 即時聚合 J連鎖反應（Real-Time PCR）
由於在研究期間實驗室的設施經過調整，本研究前半部之即時 聚合 J連鎖反應係採用 Taqman 方法 (TNF-α、TNF-β及 IL-10 的檢 測)來進行，後半部之即時聚合 J連鎖反應係採用 Sybr Green I dye 方 法。
一、Taqman 方法
取組織 RNA 4 µg，加入 25 µl 之 Master mix reagent (Applied Biosystems，TaqMan One-step RT-PCR Master Mix Reagents) 、2.5 µl 之 20X Target Primer/Probe，1.25 µl 之 40X MultiScribe and RNase Inhibitor Mix (Applied Biosystems)，最後加滅菌二次水補體積到 50 µl，之後交由 ABI Prism 5700 機器執行已經設定好的程式 (48°C 30 分鐘；95°C 10 分鐘；95°C 15 秒；60°C 1 分鐘；40 cycles)，進行 PCR 反應。
二、Sybr Green I dye 方法
取組織 RNA 2 µg，加入 25 µl 之 2X Master mix reagent (Applied Biosystems，SYBR Green PCR Master Mix) 、1 µl 之 RNase Inhibitor (2000 U，20 unit/ml) 、2.5µl 之 random hexamers (50 mM，5 nmoles)，
再加入 5µl 之 1 mM 的 Forward 及 Reverse primers 及 0.25 µl 之 40X Multiple transcriptase （ Applied Biosystems ， TaqMan Reverse Transcription Reagent），最後加二次水補體積到 50 µl，之後交由 ABI Prism 5700 機器執行已經設定好的程式，進行 PCR 反應。
三、使用之引子 (primers) 如表一所列。
第四節 數據與統計
本研究之數據（標的 mRNA 以即時聚合 J連鎖反應檢測所需之 週期數）係以平均值 ± 標準差（mean ± standard deviation, SD）來表 示。組別間的差異係以變異數分析（analysis of variance，ANOVA）
計算，若 P 值< 0.05 即視為有意義之差別。
表一、本研究即時聚合 J連鎖反應所採用之引子
項 目 引子序列
Actin Sense GGT CAG GTC ATC ACT ATC GGC A Anti-sense ACC CAG GAA GGA AGG CTG GA IFN-γ Sense CGC GTC TTG GTT TTG CAG CT
Anti-sense GGC TTT CAA TGA GTG TGC CTT G TNF-a Sense TAC TGA ATC TCG GGG TGA TTG GTC C
Anti-sense CAG CCT TGT CCC TTG AAG AGA ACC TGF-ß Sense CTT CAG CTC CAC AGA GAA GAA CTG C
Anti-sense CAC GAT CAT GTT GGA CAA CTG CTC C IL-10 Sense GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT TGC
Anti-sense CAC TGC CTT GCT CTT ATT TTC ACA
第五章 研究結果