本研究所採用兩種不同的門脈高壓動物模式除了引起門脈高壓 的機制不同之外，BDL 大白鼠比 PVL 大白鼠多了因膽管阻塞導致肝 臟受損及纖維化的過程，在細胞激素的變化應更為繁複雜。然而，由 於動物體內過百種的細胞激素乃互相作用而形成繁複的網絡，不同細 胞也在交互影響的情況下釋放不同的細胞激素。單從血中細胞激素的 濃度無法了解局部器官系統在其中的角色，更徨論探討細胞激素在某 種病症所涉及的機制。故本研究以動物肝臟組織為材料，去檢視這兩 種不同的門脈高壓動物模式的細胞激素基因表現，進而有助於明瞭其 在門脈高壓可能涉及之致病機制。
無論是肝硬化實驗動物﹝78﹞或病人﹝116,117﹞血清 TNF-α均 會上升，且上升之程度與肝硬化的嚴重度相關﹝118﹞。血清 TNF-α 上升的原因一般認為是與患者血中內毒素增加有關﹝73﹞，但 TNF-α 上升對肝硬化之高血流動力循環所扮演的角色仍有爭議，支持與反對 者各有論調﹝119,120﹞。由於肝硬化患者血中 TNF-α的來源主要是 來自周邊血液單核球（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），
並造成全身性的血流動力學變化。在肝臟之內的單核球（包括 Kupffer 細 胞 ）是否也受到血中內毒素增加的影響， 繼而增加在肝內的 TNF-α，至今仍未有定論。本研究以 real time PCR 檢測以 PVL 及 BDL 大白鼠肝臟組織 TNF-α之 mRNA，顯示兩者之表現相近；雖然此二 組之 TNF-α表現傾向高於接受假裝手術之大白鼠（分別為 1.26 倍及 3.24 倍），但並未達到顯著差異。表示肝硬化病患 TNF-α濃度上升及 引發的影響（包括刺激 iNOS 產生 NO）主要是發生在全身循環中；
而在肝臟之內 TNF-α濃度上升並不明顯，故無助於增加肝臟中 NO 的 生產。
TGF-β是一種涉及功能極廣的細胞激素，在肝臟中它具有
活 化 HSCs﹝67﹞及增加α1(I) 膠原之 mRNA﹝68−70﹞，參與肝臟纖 維化的重要機制。在肝硬化的患者中，其血漿 TGF-β濃度較常人為高
﹝118,121,122﹞；研究亦發現這些病患及接受膽管結紮的動物的肝臟 組織內之 TGF-β亦稍有增加﹝123,124﹞。本研究顯示 BDL 大白鼠肝 臟組織 TGF-β mRNA 含 量 與 Sham 大白鼠者相近（0.97 vs. 1）， 而 PVL 大白鼠則反而偏低（是 Sham 大白鼠的 0.5 倍），惟其間之差異 並未達統計學意義。 Napoli 等人﹝124﹞係在大白鼠接受膽管結紮 後 2 天至 3 週取出肝臟檢查 TGF-β mRNA 而發現明顯上升；我 們 則 是 在 大白鼠接受膽管結紮後六週才取出肝臟（此的肝硬化及門脈 高壓皆已形成），此時並無 TGF-β mRNA 上升的蹟象。涉及之原因 仍有待探討，目前的推論假設是大白鼠的肝臟在術後三至六週啟動了 代償的機制，致使 TGF-β的基因表現沒有繼續增加。因 此，未 來 將 要 在 多 個 時 段 加 作 連 串 的 檢 測 ， 並 繼 續 探 索 其 中 之 機 制 。
跟上述兩種細胞激素一樣， IFN-γ具有多項生理功能 ，包 括 可促進巨噬細胞產生 NO 以導致內臟血管擴張﹝ 125﹞，而肝硬 化患者血清 IFN-γ亦高於常人 ﹝ 126﹞。本研究結果顯示，接 受 門靜脈結紮的大白鼠 IFN-γ之基因表現最高，而接受膽管結紮的大 白鼠則與接受假裝手術之大白鼠具有相同之 IFN-γ基因表現 ，惟 三 組 間 之 差 異 尚 未 達 統 計 意 義 。
在本研究中最重要的發現是 BDL 大白鼠 IL-10 的基因表現遠低 於其他兩組（PVL 大白鼠的 IL-10 mRNA 是 Sham 大白鼠的 0.93 倍；
BDL 大白鼠的 IL-10 mRNA 則只有 Sham 大白鼠的 0.02 倍，p < 0.05）。
研究顯示，IL-10 具有保護肝臟受損的功能﹝127,128﹞，而內生性或 外來的皮質類固醇可促進 IL-10 釋出而可減輕肝臟在急性毒物傷害所 引發的損傷﹝129–132﹞。在肝臟受損而 HSCs 被活化的初期 IL-10 的 產 生 便 會 增 加， 若 此 一 反 應 失 效 即 會 令 組 織 之 纖 維 化 惡 化
﹝133,134﹞。
Lee 等人﹝135﹞在大白鼠接受 BDL 之後 1 至 10 週檢查其血中 IL-10 濃度，顯示血中 IL-10 在前兩週明顯地上升，但在第四週以後 則降至比對照組第 1、2 週時的濃度更低。可惜此群研究者並沒有做
好對照（每一時段只以一隻大白鼠為對照），也沒有對此現象作任何
詮釋！至於在肝硬化患者或動物模式肝臟 IL-10 基因表現的情況卻罕 有報告。本研究之 BDL大白鼠是在術後第六週取出肝臟，其肝臟 IL-10 之基因表現與 Lee 等人的報告似乎相符。然而，血中 IL-10 的來源並 非以肝臟為主；因此，肝臟 IL-10 之基因表現下降並不是血中 IL-10 下降的主要原因。至於為何 BDL 大白鼠在術後第六週時肝臟 IL-10 之基因表現下降至 Sham 大白鼠的 0.02 倍，目前仍未有明確的機制。
但從 Lee 等人的報告﹝135﹞中獲悉，大白鼠在接受 BDL 手術後 IL-10 先是猛然上升，這可能是為要抗衡 TNF-α等細胞激素在肝臟受損早期 所導致的續發性傷害；但其後這種防護機制因某些原因瓦解，IL-10 基因表現不足不單是在肝臟，而是發生在全身而致血中 IL-10 顯著下 降。可能由於這個原因，使 BDL 大白鼠肝臟受損的情況失去制衡而 很快便步入肝硬化的階段。
第二節 其他相關性討論 一、實驗技巧及方法之心得
以一個臨床醫師，經十餘年後再踏入分子生物及分子生物實驗
領域，使自己的視野更加開闊，比較不會排斥接受期刊中有關分生及 分生實驗的文章。雖然至目前為止對於分生實驗的部份依然自信不 足，但至少在耳熟能詳的 PCR 能親身進一步的了解。
傳統上 RT-PCR 的原理乃是利用 RNA反轉錄成 DNA，再由 DNA 為模板進行聚合? 鏈鎖反應。在完成 PCR 後必須再將標本「跑膠」
後，再作半定量或定量的分析。而本實驗使用的即時反轉錄聚合? 鏈 鎖反應則有以下的好處：
1. 可較準確地測定核酸的量。
2. 聚合? 鏈鎖反應的放大過程可以追蹤偵測而不是只測定反應後的 終產物。
3. 偵測的標的物可以是去氧核醣核酸，也可以是核醣核酸。
4. 節省時間（少於二小時）。
5. 有大的動態偵測範圍。
6. 封閉的試管。
7. 不用電泳。
8. 不用後聚合? 鏈鎖反應的處理過程。
而本研究採用了兩種偵測聚合? 鏈鎖反應的方法：（1）SYBR Green I Dye 的方法：乃是利用 SYBR Green I Dye 結合雙股 DNA 的小 溝（minor groove）而產生螢光反應。（2）TaqMan Probes 的方法：乃 是利用一段帶有報告者（reporter）及冷? 者（quencher）的特殊探針
（probe）與雙股 DNA 結合，當再放大一雙股 DNA 時可產生螢光反 應。兩種方法的優缺點如下：
1. SYBR Green I Dye 的方法：
a. 較便宜可省下探針的發費 b. 理想的篩檢工具
c. 必須要作聚合? 鏈鎖反應解離曲線 d. 無法同一試管做多個基因分析 e. 微量的檢體易產生錯誤的訊號 2. TaqMan Probes 的方法：
a. 專一性高。
b. 使用不同報告者即可同時偵測多個基因。
c. 螢光值可直接代表聚合? 鏈鎖反應增加量。
d. 不可逆式的訊號累積。
e. 價錢較貴。
二、在學習過程中獲得的啟示
在此次的學習過程中，由於閱讀諸多參考文獻資料，使吾人更能 深入了解各種細胞激素及 NO 在肝硬化及門脈高壓所扮演的角色，因 此能更明瞭肝硬化的生理及病理機轉。也因此獲取有關各種細胞激素 及其拮抗劑應用於臨床治療上的可能性，比如 TNF-α及 IL-12 可能 作為病毒性肝炎的治療藥物。TNF-α及 IFN-γ也有潛力作為抗肝癌 的實驗藥物。在往後的研究領域上，希望可應用於 C 型肝炎及酒精 性肝炎的基礎研究上，使臨床的工作與基礎研究能有進一步的結合。
今後對於肝臟分子生物學的領域，也因分子生物學及分子生物實驗的 進一步了解，應有更深刻的啟發。
第三節 研究限制 一、動物模式
本研究所採用的動物模式PVL 及 BDL 大白鼠，都是經確認的 門脈高壓模式。雖然如此，動物與人體的狀況終究不完全相同，故從
動物實驗中觀察到的現象，不一定會發生在病人身上。如 BDL 大白 鼠在術後第四週開始血中 IL-10 濃度下降﹝135﹞，但膽管阻塞的病 患血中 IL-10 濃度的變化則從未有人報告。在文獻上僅有對原發性膽 汁性肝硬化患者的研究，但結果卻大為分歧﹝136,137﹞。因此，在 動物實驗得到的資訊和啟示，必須在病人身上予以印證，才能得到有 用的結果。
二、檢測基因表現的方法
本研究係以 real time PCR 測定動物肝臟組織的 mRNA 來研判其 肝臟組織對不同細胞激素的基因表現。雖然本研究團隊對 real time PCR 的操作技巧已甚能掌握，在嚴謹的控制下結果之可信度甚高。但 如能加作免疫組織化學染色則更佳，因為只做 real time PCR 無法充 分獲知哪一種細胞激素由何種細胞分泌。如果能有免疫組織染色法，
來獲知分泌細胞激素的真正位置與細胞種類將使實驗更加完備。
第七章 結論與建議