A. 實驗動物 (Animals)
雄性 Wistar 大白鼠，於 5 週齡時，體重約 120 g～170 g (樂斯 科生物科技股份有限公司, ROC)，以每籠 3 隻飼養於國立臺灣師範 大學生命科學學系動物房，八週齡始進行實驗，體重約 250 g～320 g。
動物房採 24 小時自動溫濕調控，維持室溫 25～27 ℃，照明採 12/12 小時自動光暗週期調控，早上 7 時亮燈、晚上 7 時關燈，動 物可自由取用水及飼料。所有實驗進行皆配合動物光週期，研究方法 經國立臺灣師範大學實驗動物管理委員會認可，實驗動物的照顧使用 均依農委會所訂定之規章。
B. 實驗藥品 (Drug)
Fluoxetine (PROZAC® , 百憂解) 購自禮來大藥廠 (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA)，為臨床抗憂鬱治療藥錠 (Gibbons et al., 2012)。配製濃度為 20 mg 溶於生理食鹽水至 10 mL，過濾滅菌 後以周邊腹腔注射 (intraperitoneal injection, i.p.) 投予約 8 mg/ kg (Olivares et al., 2012)。
二、研究方法
A. 動物手術 (Animals surgery)
甲狀腺摘除組 (Thyroidectomy group)
動物皆以 sodium pentobarbital (50 mg/ kg, i.p.) 進行麻醉，經測 試確認無痛覺反應，即可視為麻醉成功。將大白鼠腹面頸部毛髮剃除，
以 70 % 酒精消毒手術部位及器具，依序將表皮、皮下組織、肌肉層 劃開並以止血鉗固定，使氣管與甲狀腺露出。甲狀腺附於氣管兩側上 呈深粉紅色，先分離氣管兩側與甲狀腺連接處，再將棉花棒靠著甲狀 腺以轉動方式輕緩的剝除兩側甲狀腺。
甲狀腺剝除完成，將肌肉層與皮下組織以碘酒消毒後，逐層以 CHROMIC 線 (4/ O, 佳合醫材股份有限公司, ROC) 以連續縫合 法縫合，表皮則以 NYLON 線 (4/ O, 佳合醫材股份有限公司, ROC) 以間歇縫合法縫合後，同以碘酒消毒。手術後七天為動物復 原期，不進行任何實驗處理。
偽手術對照組 (Sham-operated group)
動物麻醉與傷口開啟流程同甲狀腺摘除組，但不移除附於氣管兩 側的甲狀腺，而直接將傷口以相同方法依序消毒縫合，並給予七天復 原期。
B. 甲狀腺素濃度測定 (Thyroid hormonal determinations)
以 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 方法檢測實驗動 物犧牲時血清中甲狀腺素的含量。參照 CALBIOTECH 之操作流 程：
Thyroxine (T4) and Triiodothyronine (T3) ELISA.
混合 10 (25) μl 的待測血清及標準液，再加入 100 μl T4
(T3)-enzyme conjugate solution 後在室溫作用 1 小時。接著將液體全 部移除，加入 300 μl wash buffer 清洗三次。之後加入 100 μl TMB substrate solution 作用 15 分鐘，再加入 50 μl stop solution 使兩溶液 混合 20 秒後，將 well 放入 ELISA Reader 讀取 450 nm 之吸光值，
此過程需在加入 stop solution 後 15 分鐘內完成。
C. 自發性運動行為監測 (Locomotor activity monitoring)
此行為實驗為藉觀察大白鼠之活動能力及自發性探索行為來探 討投予 fluoxetine 是否影響其運動能力，以及排除手術可能造成的運 動功能改變。以下簡述實驗器材及方法：將動物置於 42×42×36 (cm) 的黑色壓克力箱中，並在正上方以小型直立式攝影機攝影，再經由 EthoVision 軟體 (ver.2.3, Noldus,Wageningen, NLD) 運算每秒鐘六
次老鼠中心點的位置變化，並分析十分鐘內老鼠水平移動情形 (distance of horizontal movement)。
D. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM)
EPM 為廣泛用於檢測動物焦慮行為 (anxiety-like behavior) 之 模式，主要利用老鼠因天生對高度及開闊空地的恐懼而影響其探究行 為表現，若焦慮程度較低，則探索開放空間之時間會較長 (Pellow et al., 1985)。因此本實驗以此行為測試探討動物在甲狀腺摘除後及投予 fluoxetine，對實驗動物的焦慮表現是否造成影響。以下簡述測試儀器 及操作方法：高架十字迷宮為一距地面高度 50 cm、臂寬 15 cm、單 臂長 75 cm 的黑色壓克力平台，四臂路徑延伸似中文「十」字，相 對兩臂分別為開放臂 (open arms) 及封閉臂 (closed arms)，其中封閉 臂有 45 cm 高的壓克力牆，儀器上方有小型直立式攝影機拍攝。以 EthoVision 軟體記錄每秒鐘拍攝六次的動物中心點位置變化，計算老 鼠 10 分鐘內在開放空間及封閉空間內停留的相對時間比。
E. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST)
此行為模式主要是利用老鼠怕水的習性來觀測其表現憂鬱的程
度，若是正常老鼠在水中會持續奮力掙扎，但具有憂鬱 (depression) 傾向的老鼠，在水中掙扎的情形會明顯下降，即不動時間 (immobility time) 較長 (Porsolt et al., 1977)。實驗裝置及操作如下：以透明直徑 18 cm、高 50 cm 的壓克力圓筒，填入水高 38 cm，令老鼠尾端不及 裝置底部，並維持水溫 25 ℃，再將老鼠投入水中強迫游泳。此實驗 程序共兩日，第一天先將老鼠投入水中持續 15 分鐘後撈起，並以 60 W 加熱燈照射 20 分鐘維持體溫。經 24 小時後進行第二天實驗，
將老鼠投入水中 5 分鐘後撈起，同以加熱燈照射。動物兩日行為表 現皆以錄影機記錄，並累計第二天大白鼠在水中時，同時呈現四肢及 尾部不動之時間作為 immobility time 進行比較。
F. 灌流及擷取腦組織 (Perfusion and brain dissection)
動物完成行為實驗及全部處理後經 24 小時，以 sodium
pentobarbital (50 mg/ kg, i.p.) 進行麻醉後固定四肢，剪開毛皮並由胸 骨劍突處向上剪開皮膚與胸骨，再以開胸器撐開胸腔露出心臟，將連 接生理食鹽水之針頭插入至左心室後以止血鉗固定，開啟蠕動幫浦，
同時剪開右心房使血液流出。待生理食鹽水完全置換出血液後，再灌 入 4 % paraformaldehyde 溶液以固定組織。
灌流完畢後斷頭犧牲，由老鼠頭部枕骨大孔處剪出缺口，用虎鉗 掀開頭蓋骨，再以小彎鑷剔除腦膜及結締組織，以不傷害腦組織為原 則將腦與腦殼分離挑出。將取出的腦浸泡在冰冷的 4 %
paraformaldehyde 進行後固定處理。隔日將腦移至 20 % 蔗糖溶液浸 泡至沉底，再換入 30 % 蔗糖溶液待其下沉完成腦組織的水分置換，
再將腦以乾冰急速冷凍，存放於 -80 ℃冰櫃。
G. 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry, IHC)
組織冷凍切片 (Frozen section)
將冷凍的腦利用冷凍切片機 (Leica CM3050 S,Wetzlar, GER) 進 行組織切片，厚度為 25 μm，依 Paxinos and Watson 所繪製之標準化 腦部立體定位圖 (Paxinos and Watson, 1997) 切出所需之部位。以四 循環方式蒐集腦組織切片，皆以培養盤盛裝，利用 free floating 方式 處理。
Doublecortin (DCX)
先以 0.1M PBS 緩衝液清洗 3 次，每次 5 分鐘，之後不同處 理間也都以 PBS 做相同的清洗步驟。首先，放入 0.01 M sodium citrate 於 85 ℃水域槽中 20 分鐘進行 antigen retrieval (參見溶液配
製)，再緩慢降回室溫。利用 3 % H2O2 作用 10 分鐘後，換入 blocking solution (參見溶液配製) 處理 1 小時，再加入 doublecortin (1:400, Senta Cruz, Dallas, TX, USA) 放置於室溫作用一天。接下來在室溫下 以二抗 (biotin conjugated donkeyanti-goat IgG, 1:5000, Jackson
Immuno- Research, West Grove, PA, USA) 作用 1 小時後，再以三抗 (strepvidin-HRP, 1:5000, Jackson Immuno- Research, West Grove, PA, USA) 作用 30 分鐘，最後以 diaminobenzidine (DAB) 呈色，貼片封 存。
【溶液配製】
100X Antigen retrieval solution (1M, pH 6)
Citric acid 58.82 g
加水至 200 mL 前，先以 HCl 將溶液 pH 值調整到 pH 6.0 1X Antigen retrieval solution (0.01 M)
100X Antigen retrieval solution 500 μl 加水至 45 mL 後再加 9 % NaCl 至 50 mL
Blocking solution
Horse serum 20 μl Tween 20 5 μl
Triton X-100 5 μl 1X PBS 965 μl
H. 新生神經細胞及分枝計算 (measure neurogenesis and dendritic branches)
將經過 IHC 處理封存之組織，在放大倍率 400X 之顯微鏡 (Olympus BX61, Shinjuku, Tokyo, Japan) 下，將 bregma 2.8~4.2 間等 分為六區段，每區段各挑取一片計數海馬迴 dentate gyrus 中
doublecortin-positive (DCX+) 之細胞數目 (Jha et al., 2011;
Montero-Pedrazuela et al., 2006) 並予以統計；另外以 MetaMorph 軟 體 (ver.7.1, Leica, Wetzlar, GER) 分析在 400X 顯微鏡 (Leica
DMI4000, Wetzlar, GER) 下觀察之 DCX+ 細胞分枝數量，評估新生神 經元之生長差異。
I. 半定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (Semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction, SQ-RT-PCR) 引子合成
先利用 Primer-BLAST 分別設計 5-HT1A receptor、5-HT2A
receptor、5-HT2C receptor、5-HT3A receptor cDNA 及 GAPDH 的引子
對 (表二)，再由基龍米克斯生物科技股份有限公司合成。
組織核糖核酸萃取與定量
將動物斷頭犧牲後，分別取出海馬迴 (hippocampus) 及縫核 (raphe nuclei) 的組織 (Andrade et al., 2004) 至 1.5 mL 微量離心管 中，混合 0.7 mL TRIzol reagent 後研磨使組織均質化，再加入 0.14 mL 的 chloroform 並劇烈搖晃使其充分混合後，室溫中靜置 3 分鐘，
再以 4 ℃, 12000 rpm 離心 15 分鐘取上清液至新微量離心管。重複 加入 chloroform 之步驟，最後取得之上清液和等體積的 isopropanol 混合，於 -80 ℃ 靜置 30 分鐘，再以 4 ℃, 12000 rpm 離心 10 分 鐘後除去上清液。接著加入 0.7 mL 70 % 酒精清洗沉澱，以 4 ℃, 10000 rpm 離心 5 分鐘後除去上清液風乾，再加入約 50 μl
DEPC-H2O 溶解，即完成 RNA 萃取，並以分光儀 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 測定 total RNA 濃度。
反轉錄聚合酶鏈鎖反應
取 1 g Total RNA、1 μl 10 M dT18 Primer、10 mM dNTP 1 μl 和 ddH2O 混合至 12 μl，65 ℃反應 5 分鐘後冰浴 2 分鐘，再加入 5X first-strand buffer 4 μl、0.1 M DTT 2 μl、ddH2O 1 μl、reverse transcriptase 1 μl，於 42 ℃反應 60 分鐘，即完成 cDNA 的製備，接著以 70 ℃ 15 分鐘終止反應，存放於 -20 ℃冰櫃。
之後進行 PCR 反應，配製反應溶液：10 mM dNTP 混合液 1 μl、
10 μM 引子對 1 μl、10Ⅹ ProTaq buffer 1 μl、5μM Taq (GeneMark, Atlanta, Georgia, USA) 0.2 μl、cDNA 1 μl 和 ddH2O 至 50 μl。以熱循 環儀 (Bio-Rad,Berkeley, CA, USA) 進行 PCR，反應條件：置於 94
℃中 5 分鐘使 DNA 雙股裂解後，進入 94 ℃30 秒，適當鍊合溫度 30 秒 (表二)，72 ℃ 1 分鐘共進行 30 個循環，最後以 72 ℃作用 7 分鐘。反應完成後取 5 μl 產物加 1 μl 6Ⅹ loading dye 進行瓊脂凝膠 (2 %) 電泳分析。
J. 統計方法 (Statistical analysis)
各項實驗數值以 Mean ± S.E.M 來表示。第一階段之實驗以 Student's t test 作比較，第二、三階段之實驗以 one way ANOVA (Dunnett’s test) 進行分析，皆以 p < 0.05 被認定具有統計上之顯著差 異。