◆ 第一階段：
建立甲狀腺摘除 (thyroidectomized) 之動物模式並探討甲狀腺摘 除後引發的生理和行為變化。
實驗 1-1
A. 實驗設計說明
本實驗使用 8 週齡 (P58) Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重 均分，再依前述手術處理。紀錄並比較手術當週 (P58) 至手術後四 週 (P87) 動物每週的體重變化，以了解摘除甲狀腺對生長的影響。
組別如下：
Group 1 (Sham)：Sham 保留甲狀腺。
Group 2 (Tx)：Thyroidectomy 摘除甲狀腺。
B. 實驗結果說明
實驗結果如圖一所示。Tx 組的體重在手術後逐週降低，且在 11 週 ( p = 0.0307) 始與 Sham 組達統計上顯著差異。上述結果顯示，
摘除甲狀腺後會對動物的體重變化有顯著的影響。由於摘除甲狀腺會 使大白鼠代謝調控異常而導致體重減輕 (Andó et al., 1990)，因此，體 重的改變可同時作為甲狀腺摘除成功的指標之一。
實驗 1-2
A. 實驗設計說明
於實驗 1-1 中使用之大白鼠，於十二週齡 (P87) 犧牲取得血清 後，依照前述 ELISA 方式測定 T3、T4 濃度，以確認是否成功建立 甲狀腺摘除之動物模式。
B. 實驗結果說明
實驗結果如圖二、三所示。Tx 組血清中的 T3 濃度顯著低於 Sham 組 ( p = 0.0008) (圖二)；Tx 組血清中的 T4 濃度顯著低於 Sham 組 ( p = 0.0026) (圖三)。此結果顯示，摘除甲狀腺後，動物血 清中 T3、T4 濃度皆會明顯的降低。由於甲狀腺摘除後，會影響甲 狀腺素分泌與調節，因此由動物血清中 T3、T4 濃度降低，可證實 甲狀腺摘除成功。
實驗 1-3
A. 實驗設計說明
於實驗 1-1 中使用之大白鼠，在 P80~P83 時分別進行高架十字 迷宮、自發性運動行為監測及強迫游泳之行為測試，以瞭解甲狀腺的 摘除對於動物運動功能及行為表現的影響。
實驗流程如下：
B. 實驗結果說明
1. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM)
實驗結果如圖四所示。兩組動物在 (a) 進出開放臂次數未達統計 上的顯著差異 ( p = 0.2535)，在 (b) 開放臂停留時間上也未達顯著差 異 ( p = 0.0862)，顯示甲狀腺摘除與否，對動物行為焦慮程度的影響 不明顯。
2. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM)
實驗結果如圖五所示，兩組動物的平均水平移動距離未達統計上 之顯著差異 ( p = 0.2881)。此結果顯示，甲狀腺摘除與否，不會改變 大白鼠自發性運動行為的表現，可排除甲狀腺可能因影響運動能力而 改變行為測試結果的結果。
3. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST)
實驗結果如圖六所示。Tx 組在水中靜止不動的時間較 Sham 組 長，統計上達顯著差異 ( p = 0.0282)。顯示摘除甲狀腺會使動物表現 出類憂鬱行為。
實驗 1-4
A. 實驗設計說明
於實驗 1-1 中使用之大白鼠，經實驗 1-3 行為測試後，於 P87 灌流取腦組織，再依照前述方法組織切片後以 IHC 方法進行 DCX 染色，計算在海馬迴 DG 中的 DCX+ 細胞數量，以評估神經新生 現象的變化。
B. 實驗結果說明
實驗結果如圖七所示。Tx 組在海馬迴 DG 的 DCX+ 細胞數量 顯著較 Sham 組多 ( p = 0.0414)，顯示此摘除甲狀腺誘發之類憂鬱行 為的產生主要因素並非海馬迴成體神經新生現象減少。
◆ 第二階段：
第一階段實驗結果顯示，大白鼠在甲狀腺摘除後三週會表現類 憂鬱行為，但並未如前人觀察到在 DG 的新生神經元有減少的現象，
因此為進一步探討其憂鬱行為之可能機轉，進行了藥物投予。
實驗 2-1
A. 實驗設計說明
本實驗為藥物施用前測。使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術 前按體重均分，皆施予偽手術處理，並於手術後一週 (P65) 開始投 藥至 P86。紀錄動物每週的體重變化，並於 P80~P83 進行 EPM、LM 及 FST 行為測試，以排除投予 fluoxetine 對動物生長及運動行為可 能產生的影響。
組別如下：
Group 1：Saline
保留甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。
Group 2：Fluoxetine
保留甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。
實驗流程如下：
B. 實驗結果說明
1. 體重 (Body weight)
實驗結果如圖八所示。Fluoxetine 組與 Saline 組之體重至 12 週 ( p
= 0.246) 皆無顯著差異，表示單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對動 物體重變化有顯著影響。
2. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM)
實驗結果如圖九所示。兩組動物在進出開放臂次數 (圖 a.) 未達 統計上的顯著差異 ( p = 0.1562)，在開放臂停留時間 (圖 b.) 上也未 達顯著差異 ( p = 0.1826)，顯示單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對 動物行為焦慮程度有影響，可排除投藥可能影響其運動能力而改變行 為測試結果的結果。
3. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM)
實驗結果如圖十所示。兩組動物的平均水平移動距離不達統計上 之顯著差異 ( p = 0.2846)。此結果顯示，單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對大白鼠自發性運動行為表現有顯著影響，可排除投藥可能影響 其運動能力而改變行為測試結果的結果。
4. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST)
實驗結果如圖十一所示。兩組動物的靜止不動時間未達統計上之 顯著差異 ( p = 0.9757)。顯示單獨投予該劑量的 fluoxetine 不會對大 白鼠表現靜止不動時間有顯著影響。
實驗 2-2
A. 實驗設計說明
本實驗使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，再 依前述手術處理。紀錄並比較 P58~P87 動物每週的體重變化，以了 解摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 對生長的影響。組別如下：
Group 1：Sham + Saline
保留甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。
Group 2：Thyroidectomy + Saline (Tx + Saline) 摘除甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。
Group 3：Thyroidectomy + Fluoxetine (Tx + Fluoxetine) 摘除甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。
B. 實驗結果說明
實驗結果如圖十二所示，Tx + Saline 組的體重在手術後逐週降低，
且在 11 週 ( p = 0.0086 ) 時與 Sham + Saline 組達統計上顯著差異；
而 Tx + Fluoxetine 組的體重也在手術後逐週降低，並在 11 週 ( p = 0.0086 ) 時 與 Sham + Saline 組 達 統 計 上 顯 著 差 異 ， 但 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組至 12 週 ( p = 0.8358 ) 皆未有顯著 差異。上述結果顯示，摘除甲狀腺後無論是否投予 fluoxetine，皆會 對動物的體重變化有顯著的影響，並證實手術成功。
實驗 2-3
A. 實驗設計說明
於實驗 2-2 中使用的大白鼠，於 P87 犧牲取得血清後，依照前 述 ELISA 方式測定 T3、T4 濃度，以確認是否成功建立甲狀腺摘除 之動物模式。
B. 實驗結果說明
實驗結果如圖十三、十四所示。Tx + Saline 組血清中的 T3 濃 度顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Fluoxetine 組血清 中的 T3 濃度也顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Saline 組與 Tx + Fluoxetine 組則無顯著差異 ( p = 0.2839) (圖十三)。
Tx + Saline 組血清中的 T4 濃度顯著低於 Sham + Saline 組 ( p <
0.0001 )；Tx + Fluoxetine 組血清中的 T4 濃度也顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Saline 組與 Tx + Fluoxetine 組則無顯著 差異 ( p = 0.604 ) (圖十四)。此結果顯示，摘除甲狀腺後無論是否投 予 fluoxetine，動物血清中 T3、T4 濃度皆有明顯的降低，且不因投 予 fluoxetine 而回復，同時證實甲狀腺摘除成功。
實驗 2-4
A. 實驗設計說明
於實驗 2-2 中使用的大白鼠，在 P80~P83 時分別進行 EPM、
LM 及 FST 之行為測試，以瞭解摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 對於 動物運動功能及行為表現的影響。
實驗流程如下：
B. 實驗結果說明
1. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM)
實驗結果如圖十五所示。Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 (a) 進出開放臂次數 ( p = 0.9695) 及 (b) 開放臂停留時間 ( p = 0.8647) 皆未達統計上顯著差異。此結果顯示，摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 不會對動物行為焦慮程度的改變有顯著影響。
2. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM)
實驗結果如圖十六所示。Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組的 平均水平移動距離 ( p = 0.8603) 未達統計上顯著差異，顯示摘除甲 狀腺後投予 fluoxetine 對大白鼠自發性運動行為的表現不會有明顯 的影響，可排除處理可能影響運動能力而改變行為測試結果的結果。
3. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST)
實驗結果如圖十七所示。Sham + Saline 組與 Tx + Saline 組的靜 止不動時間有顯著差異 ( p = 0.0043)，且 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組的靜止不動時間也有顯著差異 ( p = 0.0021)；而 Tx + Fluoxetine 組與 Sham + Saline 組的靜止不動時間則無統計上顯著差 異 ( p = 0.9166)。此結果顯示，投予 fluoxetine 能改善甲狀腺摘除之 大白鼠出現的憂鬱行為，且回復之行為表現與未摘除者表現無異。
實驗 2-5
A. 實驗設計說明
於實驗 2-2 中使用的大白鼠，在行為測試結束後 P87 進行灌流 犧牲取腦組織，並依照前述 IHC 方法進行 DCX 染色，以人工計算 在海馬迴 DG 中的 DCX+ 細胞數，另以 Metamorph 軟體分析 DCX+ 細胞分枝數，以評估神經新生現象的改變。
B. 實驗結果說明
1. DCX+ 細胞數 (Number of DCX-positive cells)
實驗結果如圖十八、十九所示。Tx + Saline 組與 Sham + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞數未達顯著差異 ( p = 0.8757)，但 Tx + Saline 組 DCX+ 細胞平均數量有較 Sham + Saline 組多的現象。而 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞數量也未達顯 著差異 ( p = 0.7637) (圖十九)。此結果顯示，大白鼠之神經新生現象 在 長 期 腹 腔 注 射 後 ， 新 生 細 胞 數 量 可 能 與 甲 狀 腺 有 無 和 投 予 fluoxetine 與否無顯著相關。
2. DCX+ 細胞分枝數 (Dendritic branches of DCX-positive cells)
實驗結果如圖二十、二十一所示。 Tx + Saline 組與 Sham + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞分枝數未達顯著差異 ( p = 0.7025)，Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞分枝數也未 達顯著差異 ( p = 0.664) (圖二十一)。此結果顯示，大白鼠之新生細 胞分枝在長期腹腔注射後，不論投藥與否皆與甲狀腺的摘除和投予 fluoxetine 無顯著相關。
◆ 第三階段：
第二階段實驗結果顯示，大白鼠摘除甲狀腺後表現的類憂鬱行為 可藉由 fluoxetine 有效改善，但在 DG 的未成熟神經元表現仍無差 異。因此，進行此階段實驗，探討 fluoxetine 改善去甲狀腺大白鼠類 憂鬱行為可能的作用機轉。
A. 實驗設計說明
本實驗使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，再 依前述手術處理，投藥處理組在 P65~P86 間每日投藥。於 P87 犧牲 取海馬迴 (hippocampus) 與縫核 (raphe nuclei) 之腦組織，依前述方 法進行 RT-PCR 後，利用膠體電泳分析目前被認為與憂鬱較相關之 5-HT1A、5-HT2C (Lanfumey et al., 2008)、5-HT2A (Celada et al., 2004) 和 5-HT3A (Rajkumar and Mahesh, 2010) 受器的表現量，以了解摘除甲狀 腺後投予 fluoxetine 之行為回復的可能機制。組別如下：
Group 1：Sham 保留甲狀腺。
Group 2：Thyroidectomy (Tx) 摘除甲狀腺。
Group 3：Thyroidectomy + Fluoxetine (Tx + Fluoxetine) 摘除甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。
B. 實驗結果說明
1. 實驗結果如圖二十二所示。5-HT1A 受器 cDNA 在海馬迴的表現量，
Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.2848)，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.1102)，但 Tx + Fluoxetine 組表現量有 減少趨勢，且顯著較 Tx 組少 ( p = 0.0067)；另外，5-HT1A 受器 cDNA 在縫核中，Tx 組的表現量則顯著多於 Sham 組 ( p = 0.0247)，但 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組 ( p = 0.349) 和 Tx 組 ( p = 0.2585) 皆無 顯著差異。此結果顯示，大白鼠縫核的 5-HT1A 受器分布改變，可能 與甲狀腺摘除處理有關聯，而合併投予 fluoxetine 可能會影響 5-HT1A 受器在海馬迴的表現量。
Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.2848)，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.1102)，但 Tx + Fluoxetine 組表現量有 減少趨勢，且顯著較 Tx 組少 ( p = 0.0067)；另外，5-HT1A 受器 cDNA 在縫核中，Tx 組的表現量則顯著多於 Sham 組 ( p = 0.0247)，但 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組 ( p = 0.349) 和 Tx 組 ( p = 0.2585) 皆無 顯著差異。此結果顯示，大白鼠縫核的 5-HT1A 受器分布改變，可能 與甲狀腺摘除處理有關聯，而合併投予 fluoxetine 可能會影響 5-HT1A 受器在海馬迴的表現量。