探討去甲狀腺大白鼠對百憂解藥性反應之影響

全文

(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 探討去甲狀腺大白鼠對百憂解藥性反應之影響 Effects of fluoxetine treatment in thyroidectomized rats. 研究生：許韵莉 Yun-Li Hsu. 指導教授：呂國棟博士 Kwok-Tung Lu, Ph. D.. 中華民國 102 年 5 月.

(2) 誌. 謝. 經過兩年多的實驗室生涯後，今天終於能在這裡訴說心中的感動與感謝了！還記得在大二時雖不能修本系教師的通識課，呂國棟老師依然讓我旁聽，帶領我見識了神經科學領域的博大精深，也使我對於其中的奧秘越發好奇，於是，在大三時呂老師給予機會讓我能更深入學習這嚮往已久的知識領域，除了盡力提供我研究上所需物資及技術指導外，也幫助我在專業知識及邏輯思辨的能力增長，更提點我許多為人處事的道理，其中點滴在心頭，謝謝老師！同時感謝嘉大楊奕玲老師和本系林豊益老師撥冗為我口試，提供我許多論文寫作及實驗技術的寶貴意見，以及給予實驗器材的協助。另外，特別感謝海大呂明偉老師及其學生淳熙、瑜芳，和林豊益老師及其學生廷翰學長在實驗技術上給予許多指導和幫忙。在這段不算短暫的研究生涯中，我很幸運有一群很棒的夥伴給予我許多幫助和支持，伴我度過許多實驗的瓶頸，與我分享研究成果的甜美，尤其感謝作豪學長在專業知識及實驗技巧上不遺餘力的教導，並和我一起完成許多實驗成果，也謝謝民聰學長、孟昌學長、曜如學長和伯寬學長在研究過程中常提供我許多寶貴的想法和技術指導，還要特別感謝與我一同奮鬥的夥伴惠喻，總是給予我最大的鼓勵並盡心.

(3) 盡力的幫助我，最後感謝明忠學長、泰淳學長、士德學長、郁方學姊、于惠學姊、一德學長、仲昕、雅婷、郁嵐、駿逸、孟珊的支持與協助，讓我能順利的完成論文。此外，要特別感謝一群為科學研究犧牲的老鼠，以此敬悼。最後，我要感謝總是給我最大幫助和支持的朋友們以及我最愛的家人，因為有你們的鼓勵和陪伴，才讓我能繼續向前邁進，這篇論文的成果是屬於大家的，謝謝你們！.

(4) 目次. 中文摘要----------------------------------------------------------------------. II. 英文摘要---------------------------------------------------------------------- IV 第一章緒論----------------------------------------------------------------. 1. 第二章研究材料與方法------------------------------------------------- 12 第三章研究結果---------------------------------------------------------- 22 第四章討論---------------------------------------------------------------- 41 參考文獻---------------------------------------------------------------------- 48 附圖/表------------------------------------------------------------------------ 61. I.

(5) 中文摘要甲狀腺素為調節生理代謝作用的重要激素，先前動物研究也顯示，成年大鼠甲狀腺機能減退，可能會誘發憂鬱行為的表現，臨床也觀察到許多憂鬱症併發甲狀腺功能缺失的病例，而且甲狀腺素與抗憂鬱劑共同使用還能增強抗憂鬱劑的治療效果。另外，甲狀腺素的缺乏也被認為會減少海馬迴齒狀迴的成體神經新生，而海馬迴的神經新生又被認為與憂鬱症的產生及相關治療有密切關連。然而，過去多數文獻指出，血清素的神經傳導作用失衡是引發憂鬱症的主因，而常用的抗憂鬱劑－百憂解，即是以增加腦中血清素濃度，改善憂鬱行為的表現。而近年則有研究指出，長期使用百憂解治療的大鼠海馬迴內神經新生較正常大鼠多。由於甲狀腺素的調控與憂鬱症之間可能有密切的因果關連，且在憂鬱症相關研究中一直是個重要但尚未解決的難題，因此，本研究欲藉由甲狀腺摘除引發類憂鬱行為之動物模式及百憂解的投予，來釐清甲狀腺功能缺失所引發之類憂鬱行為與海馬迴成體神經新生現象及血清素神經傳導系統的可能作用路徑。初步實驗結果發現，在 8 週齡摘除甲狀腺的大鼠，在 11 週齡的強迫游泳行為測試中表現顯著的類憂鬱行為，但海馬迴齒狀迴的成體神經新生現象未減低。因此，進一步對甲狀腺摘除個體投予百憂解並觀察其行為及海馬迴內神經新生的變化，結果顯示，長期投予百憂解，可改善甲狀腺摘除後引 II.

(6) 發的類憂鬱行為，但海馬迴神經新生現象未有顯著變化。因此，以 RT-PCR 方法測定血清素相關受器 5-HT1A、5-HT2A、5-HT2C 及 5-HT3A 在海馬迴及縫核的表現量。研究結果發現，甲狀腺摘除大鼠縫核的 5-HT1A 受器表現量顯著上升，而在投予百憂解之甲狀腺摘除大鼠海馬迴中則是觀察到 5-HT1A 受器表現量顯著下降，推測甲狀腺摘除引發之憂鬱行為表現及投藥後的行為改善，可能與 5-HT1A 受器表現量的改變有關。由本研究一系列實驗結果推知，甲狀腺功能異常所造成的類憂鬱行為表現可能與血清素系統中 5-HT1A 受器的調控有較大的關聯，此項成果除幫助探究憂鬱症成因，也有助於相關治療藥物的開發。. 關鍵字：海馬迴成體神經新生現象、血清素受器、甲狀腺機能減退、百憂解、強迫游泳行為測試. III.

(7) 英文摘要 Thyroid hormones (THs) are important on the regulation of physiological functions, especially metabolism. It also modulates the rate of neuronal proliferation in the central nervous system. In hippocampus, THs are essential for the adult neurogenesis. Recent studies suggest that it also involves in the pathogenesis of atypical depression in human. It is widely accepted that major depression is resulted from the imbalance and dysfunction of serotonin (5-HT) in brain. Accumulated clinical results showed the co-treatment of antidepressants with THs have better therapeutic effect on depression patients. Fluoxetine, a serotonin selected reuptake inhibitor (SSRI), can enhance the adult neurogenesis in hippocampus. These evidences suggest that the defect of adult neurogenesis caused by the imbalances of the level of THs and 5-HT may responsible for formation of depression disorder. However, the detail mechanism remains unclear. In the present study, we investigate the possible linkage between adult neurogenesis and the depression-like behavior induced by thyroidectomies. Rats which were thyroidectomized at 8 weeks old showed increase of depression-like behavior on force-swimming test at the age of 11 weeks. It can be rescue by fluoxetine treatment. However, the level of adult neurogenesis in hippocampus did not show significant changes in the fluoxetine treated rats comparing with vehicle control animal. The expression of different serotonin receptor subtypes including 5-HT1A ,5-HT2A ,5-HT2C and 5-HT3A in the hippocampus and raphe nuclei IV.

(8) were measured by SQ-RT-PCR paradigm. Results showed revealed that the expression of 5-HT1A receptors in Raphe nuclei and hippocampus of thyroidectomized rats were up-regulated and down-regulated respectively. In addition, systemic administration of Prozac restored the expression of 5-HT1A receptor into normal level. We concluded that the increase of depression-like behavior in thyroidectomized rats is resulted from the imbalance of 5-HT function rather than impairment of adult neurogenesis in hippocampus. Further experiments are required to obtain a complete and clear picture regard to the mechanism of hypothyroidism and atypical depression.. Key words: 5-HT receptors, adult hippocampal neurogenesis, fluoxetine, forced swimming test, hypothyroid. V.

(9) 第一章. 緒論. A. 甲狀腺素 (Thyroid hormones, THs) 甲狀腺素由甲狀腺體分泌，是調控哺乳類動物生長及維持生理恆定作用的重要激素，可促進骨骼生長延長、控制身體的代謝效率、幫助胎兒在母體時 (Obregon et al., 1984; Morreale de Escobar et al., 1988, Vulsma et al., 1989) 和出生後 (Chan and Kilby, 2000; de Escobar et al., 2004) 的腦部及神經發育成熟。THs 受下視丘-腦下垂體-甲狀腺調節機制 (hypothalamic-pituitary-thyroid axis, HPT axis) 的調控：下視丘在偵測到血液中 THs 含量下降時，分泌促甲狀腺素釋素 (thyrotropin-releasing hormone, TRH) 刺激腦下垂體前葉產生促甲狀腺素 (thyroid-stimulating hormone, TSH)，甲狀腺經 TSH 刺激後會合成並分泌 THs 至血液中，待 THs 含量恢復恆定後會負回饋調控 TRH 與 TSH 的分泌 (Dietrich et al., 2012)。THs 主要有兩種結構： thyroxine (T4) 和 triiodothyronine (T3)，兩者皆為酪胺酸碘化物，T4 活性較低但半衰期較 T3 長，因此在血液中恆定濃度較 T3 高。兩者在合成時皆需碘 (iodine) 的參與，若體內缺乏碘時，會造成 T4、 T3 濃度下降，可能引起甲狀腺機能減退 (hypothyroidism) (Markou et al., 2001)。在人體內，T4、T3 的反應活性可藉由活化不同型脫碘酶 1.

(10) (deiodinases) 進行多種代謝作用來調節，T4 也可藉第二型脫碘酶 (type-II deiodinase) 轉換為活性較佳的 T3 (Tanaka et al., 1981; Courtin et al., 1988; Kansagra et al., 2010)。. B. 甲狀腺素對精神健康的影響 (The effect of THs in mental health) 在過去的研究中，THs 的功能調控也一直被認為與情感疾病 (affective disorder) 的表現有關。早在 1825 年 Parry 的研究即指出，甲狀腺異常會增加情感疾病的發生率，近年許多相關的動物行為研究更顯示 THs 會影響個體的認知和情緒功能，例如：THs 受器 α (TRα) 缺失的小鼠，在空間學習和記憶的莫氏水迷宮 (Morris water maze) 表現會較正常小鼠差，且會增加焦慮的情形 (Wilcoxon et al., 2007)；在高架十字迷宮 (elevated plus maze) 的實驗中，甲狀腺機能亢進症 (hyperthyroidism) 之成年大鼠停留在開放臂 (open arms) 中活動的時間增加，進出各臂的次數也增加 (Redei et al., 2001)；而甲狀腺機能亢進症 (Redei et al., 2001) 或減退症 (Kulikov et al., 1997) 的成年大鼠，在強迫游泳測試 (forced swimming test) 中的靜止不動時間 (immobility time) 都會明顯高於正常老鼠。目前許多研究推測，THs 與神經傳導相關系統的交互作用可能是造成情感疾病的原因 (Bauer et al., 2002)。在動物實驗中，甲狀腺機能亢進症大鼠腦中的血清素濃. 2.

(11) 度會增加，而甲狀腺機能減退症大鼠腦中的血清素濃度則會減低 (Singhal et al., 1975)；在臨床研究則已證實，人類的 TSH 和 T3 的循環調控與中樞系統的血清素 (serotonin) 和多巴胺 (dopamine) 的水平有關 (Strawn et al., 2004)。另外，常用的選擇性血清素回收阻斷劑 (selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI)－百憂解 (fluoxetine) 也被發現能顯著促進大鼠第二型脫碘酶作用，並抑制能將 T4、T3 轉化為不具活性的 3,3',5'-triiodothyronine 或 3,3'-diiodothyronine 的第三型脫碘酶 (type-III deiodinase) 的活性 (Eravci et al., 2000)。. C. 憂鬱症與抗憂鬱劑 (Depression and antidepressant) 憂鬱症 (depression) 現代一種常見的情感性精神疾病。依據聯合國世界衛生組織 (World Health Organization) 預估，憂鬱症將在 2020 年成為造成人類失能 (disability) 的首要疾病，並將憂鬱症與癌症、愛滋病並列為二十一世紀三大疾病。憂鬱症臨床症狀主要有：持續性心情沮喪、失去動機或興趣、注意力不集中、產生自殺意念及行為等，由於病徵多樣且因人而異，目前判定標準主要依照 DSM-IVTR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV-TR)，可粗分為重鬱症 (major depression disorder) 及神經官能性憂鬱障礙 (dysthymic disorder) 兩類 (Nease and Maloin, 2003)。. 3.

(12) 憂鬱症的病因一直是許多研究討論的重點，因其異質性高，許多科學家提出不同的假說，至今也尚未有定論。最初，憂鬱症被認為是心理因素引起的一種心理狀態失調，但隨著許多研究發現腦神經可透過不同的神經傳導物質 (neurotransmitter) 調控動作、情緒與記憶等認知行為後，於 1960 年代後半開始有許多文獻提出「單胺類假說」 (monoamine hypothesis)，主張憂鬱症的主要成因是神經傳導物質中的多巴胺、正腎上腺素 (norepinephrine) 及血清素在體內的濃度失衡 (Weiss et al., 1981; Goodwin and Post, 1983; Siever and Davis, 1985; Jobe et al., 1999)。其中，血清素為色胺酸 (tryptophan) 的衍生物，化學名為 5-hydroxytryptamine (5-HT)，被許多基礎及臨床研究證實與憂鬱症的病因最密切相關 (Asberg et al., 1976; Maes and Meltzer, 1995)。臨床使用抗憂鬱和穩定精神相關藥物，雖屬不同類化學物質，但許多都被發現和改變 5-HT 神經傳導有關 (Blier and de Montigny, 1994)。目前，憂鬱症的主要治療方式有心理治療 (psychotherapy)、電痙攣治療 (electroconvulsive therapy, ECT) 及抗憂鬱藥物治療 (antidepressant therapeutics) 等，詳見表一，其中抗憂鬱藥物治療中的三環類抗憂鬱劑 (tricyclic antidepressants, TCA)、選擇性血清素回收阻斷劑 (selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)、單胺氧化酶抑制劑 (monoamine oxidase inhibitors, MAOIs)、鋰 (lithium) 和 ECT. 4.

(13) 都會直接或間接增加體內 5-HT (Blier et al., 1987)。另外先前研究也發現，藉由減少體內色胺酸引發中樞 5-HT 量下降，會使 SSRI-responsive 憂鬱症病患病徵快速復發 (Delgado et al.,1994)。其他研究如：在憂鬱症患者腦脊髓液 (cerebrospinal fluid ) 中，可反映中樞 5-HT 活性的代謝產物 5-hydroxyindoleacetic acid 的量較正常人低 (Maes and Meltzer, 1995)；在臨床大腦照影的研究上也發現，憂鬱症與血清素轉運受器 (5-HT transporter) 的可用量有關 (Heinz et al., 1998; Malison et al., 1998)。由上述研究顯示，憂鬱症的致病機轉與治療可能與血清素系統立即性的訊息傳遞調控有關。抗憂鬱相關疾病藥物主要以增加神經傳導物質在突觸 (synapse) 間的濃度來緩解症狀，以下簡介常見的二類：（一）第一代抗憂鬱劑：非專一性抑制突觸間神經傳導物質，如三環及異環抗憂鬱劑 (tricyclic and tetracyclic antidepressants) 和 MAOIs；（二）第二代抗憂鬱劑：可選擇性對專一受器作用，增加特定神經傳導物質在突觸間的濃度，如 SSRI、正腎上腺素與血清素回收抑制劑 (selective serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors, SNRI )、多巴胺與正腎上腺素回收抑制劑 (dopamine and norepinephrine reuptake inhibitors, DNRI)、血清素調節劑 (serotonin modulators) 等。第一代抗憂鬱劑為早期臨床主要用藥，後發展出專一性較高的第二代抗憂鬱劑，在治療中產生的副作 5.

(14) 用及藥物交互作用，都較第一代抗憂鬱劑輕微，因此現多以第二代抗憂鬱劑作為主要治療藥物。 Prozac (學名 fluoxetine) 為常見的 SSRI 抗憂鬱劑，可抑制中樞神經對血清素的再回收，增加血清素在突觸間隙內作用的時間，且與其他如：擬交感神經激素 (adrenergic)、血清素、多巴胺、組織胺、蕈鹼毒型 (muscarinic) 及 GABA 的受器結合力極低，在人體肝臟中 fluoxetine 會被廣泛代謝為 norfluoxetine 及其他尿中代謝物，而 norfluoxetine 為一活性代謝物，作用與 fluoxetine 相當。由於 fluoxetine 在水中溶解度高且代謝過程緩慢 (短期給藥之半衰期為 1-3 天，長期給藥為 4-6 天)， norfluoxetine 半衰期為 7-15 天，因此可確保體內藥物濃度維持，但藥物濃度並不會無限制增加，符合長期慢性病治療需求 (Altamura et al., 1994)，因此，目前 fluoxetine 被廣泛用於臨床治療憂鬱相關疾病。另外，在先前動物實驗中可觀察到，對成年大鼠投予 fluoxetine，會增加其海馬迴齒狀迴(dentate gyrus, DG)的新生神經細胞，並影響中樞新生細胞的分化與成熟 (Malberg et al., 2000)；以 X-ray 阻斷小鼠海馬迴神經新生後，會減低 fluoxetine 改善憂鬱行為的治療效果 (Santarelli et al., 2003)，臨床研究也證實，在接受 SSRI 抗憂鬱劑治療的病患海馬迴齒狀迴組織中也觀察到 neural progenitor cells (NPCs) 有明顯增加的現象 (Knoth et al., 2010; 6.

(15) Boldrini et al., 2012)。綜合以上研究結果顯示， fluoxetine 之治療效果似乎與海馬迴神經新生現象密切相關。. D. 海馬迴與憂鬱症 (Hippocampus and depression) 海馬迴為邊緣系統 (limbic system) 構造之一，並陸續在動物實驗及臨床中被證實與學習記憶及情緒控制相關 (Moser and Moser, 1998)。在臨床憂鬱症患者的磁共振照影 (magnetic resonance imaging, MRI) 顯示不論性別或年紀皆會有海馬迴體積減少的現象 (Videbech and Ravnkilde, 2004; Campbell et al., 2004)，而且減少的體積大小會與憂鬱病徵發生頻率，及未接受治療的時間長短有關 (MacQueen et al., 2003)，雖然此類研究還無法直接證明憂鬱症患者的海馬迴功能缺失，但有研究利用與空間記憶相關的虛擬實境空間記憶導航測試 (virtual-reality spatial memory navigation task) 評估憂鬱症患者海馬迴的功能，發現病人的表現會顯著較正常人差 (Gould et al., 2007)。在臨床相關文獻也顯示，將近半數的憂鬱症患者皆有對壓力反應失調之情形，而海馬迴又被認為是調控下視丘-腦下垂體機制 (hypothalamic-pituitary axis) 的關鍵，能幫助調節壓力引起之相關反應 (Carroll et al., 1968; Sapolsky, 2000)；而對投予 SSRI 抗憂鬱劑的憂鬱症病患做正子放射照影 (positron emission tomography, PET)，也. 7.

(16) 顯示腦部亞屬扣帶區域 (subgenual cingulate region)、海馬迴和前額葉在代謝活動上有改變 (Seminowicz et al., 2004)，其相關作用迴路可能與皮質-邊緣迴路 (cortico-limbic circuits) 有關 (Mayberg et al., 2000)。另外，鳥類、齧齒類、非人靈長類及人類的成體腦部皆陸續被發現成年後仍然有神經新生現象的發生 (Lledo et al., 2006)。許多文獻指出，哺乳動物成體神經新生現象主要出現在側腦室旁區 (subventricular zone, SVZ) 和海馬迴齒狀迴顆粒細胞下區 (subgranular zone, SGZ) (Gross, 2000; Abrous et al., 2005; Christie and Cameron, 2006; Lledo et al., 2006)，而海馬迴的成體神經新生會影響 DG 的功能與結構，並被認為與憂鬱症的成因有關 (Wiskott et al., 2006; Becker and Wojtowicz, 2007)。此「神經性起源假說」 (neurogenic hypothesis) 主要依據以下幾個研究結論：許多有研究顯示壓力會造成海馬迴成體神經新生現象減少 (McEwen, 2003; Mirescu and Gould, 2006)，而目前普遍認為壓力是導致憂鬱症發病的因子之一；而在許多憂鬱症治療，如 ECT (Scott et al., 2000)、運動 (Ernst et al., 2006)、環境改善 (Nilsson et al., 1999) 及 SSRI 抗憂鬱劑 (Malberg et al., 2000)相關的研究中皆發現，進行治療後成體神經新生皆會有增加的現象，且有些 SSRI 抗憂鬱劑在動物成體神經新生現象被阻斷後對行為的治療效果會消失 (Santarelli et al., 2003; Airan et al., 2007)。 8.

(17) E. 甲狀腺素在憂鬱症中所扮演的角色 (The role of THs in depression) 除上述文獻指出，憂鬱症與 SGZ 中的成體神經新生現象改變可能有關連外，許多研究也證實，THs 的調控和 SGZ (Madeira et al., 1991; Ambrogini et al., 2005; Desouza et al., 2005; Uchida et al., 2005; Montero-Pedrazuela et al., 2006) 的成體神經新生現象有密切的關聯。尤其，體內 THs 不足會使成年大鼠海馬迴 DG 的新生細胞減少並影響神經細胞的成熟 (Madeira et al., 1991)，但在人工投予 THs 後此區新生細胞數目會有回復的現象 (Montero-Pedrazuela et al., 2006)。在臨床研究上，早在 1960 年代即有許多研究指出，較嚴重的甲狀腺功能缺失病患常同時具有類似憂鬱及癡呆的表現 (Whybrow et al., 1969)，至近年一項義大利的臨床研究則指出，所有參與研究的甲狀腺機能減退症病患中，有 63.5 % 被判斷具有憂鬱病徵，但單獨給予甲狀腺素治療卻無法使憂鬱病徵完全消失 (Demartini et al., 2010)。而約在 1970 前後，臨床開始出現以 THs 作為抗憂鬱治療之輔助劑，幫助加速 (accelerate) 和增進 (augment) 病人對抗憂鬱劑的反應效果。在早期臨實驗中，給予 T3 及 TCA 共同治療的非抗藥性憂鬱症 (non-refractory depression) 患者，顯現較快速且良好的治療效果 (Prange et al., 1969; Wilson et al., 1970; Wheatley, 1972; Altshuler et al., 2001)，許多研究也顯示，T3 與抗憂鬱劑共同治療可增進具抗藥性憂 9.

(18) 鬱症 (refractory depression) 患者的有效治療比例 (Aronson et al., 1996)。近年臨床抗憂鬱劑多改用治療成效更佳的 SSRIs ，因此也針對此類抗憂鬱劑與 T3 進行共同治療之研究。雖然目前還未有一致性的結果，但 Papakostas 在 2009 的 meta-analysis 中指出，T3 和 SSRIs 的共同治療可能對甲狀腺機能異常併發憂鬱症之患者較有效 (Papakostas et al., 2009)。另外，在 T4 參與情緒治療相關的研究相對較少，但許多臨床研究也指出，研究病歷中半數以上的情緒障礙患者，尤其是被判定為憂鬱症者，給予其超生理劑量的 T4 可增強抗憂鬱劑的治療效果 (Baumgartner, 2000)。至目前一系列的臨床研究中也發現，胎兒和新生兒時期 THs 缺乏會導致不可逆的心智遲緩、神經和行為上的異常及長期運動官能障礙，而在成年人中，甲狀腺機能減退可能是導致某些異常行為的原因，如：憂鬱表現、記憶與學習受損、語言不流暢及空間作業障礙等 (Miller et al., 2007; Samuels et al., 2007)。綜合過去研究可知，成年個體的甲狀腺功能異常或 THs 的調控改變時，會影響動物的行為表現及大腦特定區域的神經新生現象。在臨床上，甲狀腺機能減退的病患常被觀察到表現出憂鬱及認知功能缺失等，THs 與抗憂鬱劑的共同治療也持續被應用與研究，皆顯示了 THs 在憂鬱病徵顯現及治療上扮演關鍵性的角色。先前研究也表示甲狀腺機能減退可能誘發個體產生憂鬱病徵的表現，並推測其中關連 10.

(19) 可能與海馬迴成體神經新生現象相關，但一直未有直接的證據，各家說法也都不一。因此，本研究主要分三階段，先以成年大鼠摘除甲狀腺方式建立甲狀腺功能異常引發類憂鬱行為表現之動物模式，再以此動物模式配合 SSRI 抗憂鬱藥物的使用，分別釐清類憂鬱行為與海馬迴成體神經新生現象的關連，以及類憂鬱行為與中腦縫核和海馬迴中 5-HT 受器表現的關連。. 11.

(20) 第二章. 研究材料與方法. 一、研究材料 A. 實驗動物 (Animals) 雄性 Wistar 大白鼠，於 5 週齡時，體重約 120 g～170 g (樂斯科生物科技股份有限公司, ROC)，以每籠 3 隻飼養於國立臺灣師範大學生命科學學系動物房，八週齡始進行實驗，體重約 250 g～320 g。動物房採 24 小時自動溫濕調控，維持室溫 25～27 ℃，照明採 12/12 小時自動光暗週期調控，早上 7 時亮燈、晚上 7 時關燈，動物可自由取用水及飼料。所有實驗進行皆配合動物光週期，研究方法經國立臺灣師範大學實驗動物管理委員會認可，實驗動物的照顧使用均依農委會所訂定之規章。. B. 實驗藥品 (Drug) Fluoxetine (PROZAC® , 百憂解) 購自禮來大藥廠 (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA)，為臨床抗憂鬱治療藥錠 (Gibbons et al., 2012)。配製濃度為 20 mg 溶於生理食鹽水至 10 mL，過濾滅菌後以周邊腹腔注射 (intraperitoneal injection, i.p.) 投予約 8 mg/ kg (Olivares et al., 2012)。 12.

(21) 二、研究方法 A. 動物手術 (Animals surgery) 甲狀腺摘除組 (Thyroidectomy group) 動物皆以 sodium pentobarbital (50 mg/ kg, i.p.) 進行麻醉，經測試確認無痛覺反應，即可視為麻醉成功。將大白鼠腹面頸部毛髮剃除，以 70 % 酒精消毒手術部位及器具，依序將表皮、皮下組織、肌肉層劃開並以止血鉗固定，使氣管與甲狀腺露出。甲狀腺附於氣管兩側上呈深粉紅色，先分離氣管兩側與甲狀腺連接處，再將棉花棒靠著甲狀腺以轉動方式輕緩的剝除兩側甲狀腺。甲狀腺剝除完成，將肌肉層與皮下組織以碘酒消毒後，逐層以 CHROMIC 線 (4/ O, 佳合醫材股份有限公司, ROC) 以連續縫合法縫合，表皮則以 NYLON 線 (4/ O, 佳合醫材股份有限公司, ROC) 以間歇縫合法縫合後，同以碘酒消毒。手術後七天為動物復原期，不進行任何實驗處理。偽手術對照組 (Sham-operated group) 動物麻醉與傷口開啟流程同甲狀腺摘除組，但不移除附於氣管兩側的甲狀腺，而直接將傷口以相同方法依序消毒縫合，並給予七天復原期。 13.

(22) B. 甲狀腺素濃度測定 (Thyroid hormonal determinations) 以 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 方法檢測實驗動物犧牲時血清中甲狀腺素的含量。參照 CALBIOTECH 之操作流程： Thyroxine (T4) and Triiodothyronine (T3) ELISA. 混合 10 (25) μl 的待測血清及標準液，再加入 100 μl T4 (T3)-enzyme conjugate solution 後在室溫作用 1 小時。接著將液體全部移除，加入 300 μl wash buffer 清洗三次。之後加入 100 μl TMB substrate solution 作用 15 分鐘，再加入 50 μl stop solution 使兩溶液混合 20 秒後，將 well 放入 ELISA Reader 讀取 450 nm 之吸光值，此過程需在加入 stop solution 後 15 分鐘內完成。. C. 自發性運動行為監測 (Locomotor activity monitoring) 此行為實驗為藉觀察大白鼠之活動能力及自發性探索行為來探討投予 fluoxetine 是否影響其運動能力，以及排除手術可能造成的運動功能改變。以下簡述實驗器材及方法：將動物置於 42×42×36 (cm) 的黑色壓克力箱中，並在正上方以小型直立式攝影機攝影，再經由 EthoVision 軟體 (ver.2.3, Noldus, Wageningen, NLD) 運算每秒鐘六 14.

(23) 次老鼠中心點的位置變化，並分析十分鐘內老鼠水平移動情形 (distance of horizontal movement)。. D. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM) EPM 為廣泛用於檢測動物焦慮行為 (anxiety-like behavior) 之模式，主要利用老鼠因天生對高度及開闊空地的恐懼而影響其探究行為表現，若焦慮程度較低，則探索開放空間之時間會較長 (Pellow et al., 1985)。因此本實驗以此行為測試探討動物在甲狀腺摘除後及投予 fluoxetine，對實驗動物的焦慮表現是否造成影響。以下簡述測試儀器及操作方法：高架十字迷宮為一距地面高度 50 cm、臂寬 15 cm、單臂長 75 cm 的黑色壓克力平台，四臂路徑延伸似中文「十」字，相對兩臂分別為開放臂 (open arms) 及封閉臂 (closed arms)，其中封閉臂有 45 cm 高的壓克力牆，儀器上方有小型直立式攝影機拍攝。以 EthoVision 軟體記錄每秒鐘拍攝六次的動物中心點位置變化，計算老鼠 10 分鐘內在開放空間及封閉空間內停留的相對時間比。. E. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST) 此行為模式主要是利用老鼠怕水的習性來觀測其表現憂鬱的程 15.

(24) 度，若是正常老鼠在水中會持續奮力掙扎，但具有憂鬱 (depression) 傾向的老鼠，在水中掙扎的情形會明顯下降，即不動時間 (immobility time) 較長 (Porsolt et al., 1977)。實驗裝置及操作如下：以透明直徑 18 cm、高 50 cm 的壓克力圓筒，填入水高 38 cm，令老鼠尾端不及裝置底部，並維持水溫 25 ℃，再將老鼠投入水中強迫游泳。此實驗程序共兩日，第一天先將老鼠投入水中持續 15 分鐘後撈起，並以 60 W 加熱燈照射 20 分鐘維持體溫。經 24 小時後進行第二天實驗，將老鼠投入水中 5 分鐘後撈起，同以加熱燈照射。動物兩日行為表現皆以錄影機記錄，並累計第二天大白鼠在水中時，同時呈現四肢及尾部不動之時間作為 immobility time 進行比較。. F. 灌流及擷取腦組織 (Perfusion and brain dissection) 動物完成行為實驗及全部處理後經 24 小時，以 sodium pentobarbital (50 mg/ kg, i.p.) 進行麻醉後固定四肢，剪開毛皮並由胸骨劍突處向上剪開皮膚與胸骨，再以開胸器撐開胸腔露出心臟，將連接生理食鹽水之針頭插入至左心室後以止血鉗固定，開啟蠕動幫浦，同時剪開右心房使血液流出。待生理食鹽水完全置換出血液後，再灌入 4 % paraformaldehyde 溶液以固定組織。. 16.

(25) 灌流完畢後斷頭犧牲，由老鼠頭部枕骨大孔處剪出缺口，用虎鉗掀開頭蓋骨，再以小彎鑷剔除腦膜及結締組織，以不傷害腦組織為原則將腦與腦殼分離挑出。將取出的腦浸泡在冰冷的 4 % paraformaldehyde 進行後固定處理。隔日將腦移至 20 % 蔗糖溶液浸泡至沉底，再換入 30 % 蔗糖溶液待其下沉完成腦組織的水分置換，再將腦以乾冰急速冷凍，存放於 -80 ℃冰櫃。. G. 免疫組織化學染色. (Immunohistochemistry, IHC). 組織冷凍切片 (Frozen section) 將冷凍的腦利用冷凍切片機 (Leica CM3050 S, Wetzlar, GER) 進行組織切片，厚度為 25 μm，依 Paxinos and Watson 所繪製之標準化腦部立體定位圖 (Paxinos and Watson, 1997) 切出所需之部位。以四循環方式蒐集腦組織切片，皆以培養盤盛裝，利用 free floating 方式處理。 Doublecortin (DCX) 先以 0.1M PBS 緩衝液清洗 3 次，每次 5 分鐘，之後不同處理間也都以 PBS 做相同的清洗步驟。首先，放入 0.01 M sodium citrate 於 85 ℃水域槽中 20 分鐘進行 antigen retrieval (參見溶液配 17.

(26) 製)，再緩慢降回室溫。利用 3 % H2O2 作用 10 分鐘後，換入 blocking solution (參見溶液配製) 處理 1 小時，再加入 doublecortin (1:400, Senta Cruz, Dallas, TX, USA) 放置於室溫作用一天。接下來在室溫下以二抗 (biotin conjugated donkeyanti-goat IgG, 1:5000, Jackson Immuno- Research, West Grove, PA, USA) 作用 1 小時後，再以三抗 (strepvidin-HRP, 1:5000, Jackson Immuno- Research, West Grove, PA, USA) 作用 30 分鐘，最後以 diaminobenzidine (DAB) 呈色，貼片封存。. 【溶液配製】 100X Antigen retrieval solution (1M, pH 6) Citric acid. 58.82 g. 加水至 200 mL 前，先以 HCl 將溶液 pH 值調整到 pH 6.0 1X Antigen retrieval solution (0.01 M) 100X Antigen retrieval solution. 500 μl. 加水至 45 mL 後再加 9 % NaCl 至 50 mL Blocking solution Horse serum. 20 μl. Tween 20. 5 μl 18.

(27) Triton X-100. 5 μl. 1X PBS. 965 μl. H. 新生神經細胞及分枝計算 (measure neurogenesis and dendritic branches) 將經過 IHC 處理封存之組織，在放大倍率 400X 之顯微鏡 (Olympus BX61, Shinjuku, Tokyo, Japan) 下，將 bregma 2.8~4.2 間等分為六區段，每區段各挑取一片計數海馬迴 dentate gyrus 中 doublecortin-positive (DCX+) 之細胞數目 (Jha et al., 2011; Montero-Pedrazuela et al., 2006) 並予以統計；另外以 MetaMorph 軟體 (ver.7.1, Leica, Wetzlar, GER) 分析在 400X 顯微鏡 (Leica DMI4000, Wetzlar, GER) 下觀察之 DCX+ 細胞分枝數量，評估新生神經元之生長差異。. I. 半定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (Semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction, SQ-RT-PCR) 引子合成先利用 Primer-BLAST 分別設計 5-HT1A receptor、5-HT2A receptor、5-HT2C receptor、5-HT3A receptor cDNA 及 GAPDH 的引子 19.

(28) 對 (表二)，再由基龍米克斯生物科技股份有限公司合成。組織核糖核酸萃取與定量將動物斷頭犧牲後，分別取出海馬迴 (hippocampus) 及縫核 (raphe nuclei) 的組織 (Andrade et al., 2004) 至 1.5 mL 微量離心管中，混合 0.7 mL TRIzol reagent 後研磨使組織均質化，再加入 0.14 mL 的 chloroform 並劇烈搖晃使其充分混合後，室溫中靜置 3 分鐘，再以 4 ℃, 12000 rpm 離心 15 分鐘取上清液至新微量離心管。重複加入 chloroform 之步驟，最後取得之上清液和等體積的 isopropanol 混合，於 -80 ℃ 靜置 30 分鐘，再以 4 ℃, 12000 rpm 離心 10 分鐘後除去上清液。接著加入 0.7 mL 70 % 酒精清洗沉澱，以 4 ℃, 10000 rpm 離心 5 分鐘後除去上清液風乾，再加入約 50 μl DEPC-H2O 溶解，即完成 RNA 萃取，並以分光儀 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 測定 total RNA 濃度。反轉錄聚合酶鏈鎖反應取 1 g Total RNA、1 μl 10 M dT18 Primer、10 mM dNTP 1 μl 和 ddH2O 混合至 12 μl，65 ℃反應 5 分鐘後冰浴 2 分鐘，再加入 5X first-strand buffer 4 μl、0.1 M DTT 2 μl、ddH2O 1 μl、reverse transcriptase 1 μl，於 42 ℃反應 60 分鐘，即完成 cDNA 的製備，接著以 70 ℃ 15 分鐘終止反應，存放於 -20 ℃冰櫃。 20.

(29) 之後進行 PCR 反應，配製反應溶液：10 mM dNTP 混合液 1 μl、 10 μM 引子對 1 μl、10Ⅹ ProTaq buffer 1 μl、5μM Taq (GeneMark, Atlanta, Georgia, USA) 0.2 μl、cDNA 1 μl 和 ddH2O 至 50 μl。以熱循環儀 (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA) 進行 PCR，反應條件：置於 94 ℃中 5 分鐘使 DNA 雙股裂解後，進入 94 ℃30 秒，適當鍊合溫度 30 秒 (表二)，72 ℃ 1 分鐘共進行 30 個循環，最後以 72 ℃作用 7 分鐘。反應完成後取 5 μl 產物加 1 μl 6Ⅹ loading dye 進行瓊脂凝膠 (2 %) 電泳分析。 J. 統計方法 (Statistical analysis) 各項實驗數值以 Mean ± S.E.M 來表示。第一階段之實驗以 Student's t test 作比較，第二、三階段之實驗以 one way ANOVA (Dunnett’s test) 進行分析，皆以 p < 0.05 被認定具有統計上之顯著差異。. 21.

(30) 第三章. 研究結果. ◆ 第一階段：建立甲狀腺摘除 (thyroidectomized) 之動物模式並探討甲狀腺摘除後引發的生理和行為變化。. 實驗 1-1 A. 實驗設計說明本實驗使用 8 週齡 (P58) Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，再依前述手術處理。紀錄並比較手術當週 (P58) 至手術後四週 (P87) 動物每週的體重變化，以了解摘除甲狀腺對生長的影響。組別如下： Group 1 (Sham)：Sham 保留甲狀腺。 Group 2 (Tx)：Thyroidectomy 摘除甲狀腺。. 22.

(31) B. 實驗結果說明實驗結果如圖一所示。Tx 組的體重在手術後逐週降低，且在 11 週 ( p = 0.0307) 始與 Sham 組達統計上顯著差異。上述結果顯示，摘除甲狀腺後會對動物的體重變化有顯著的影響。由於摘除甲狀腺會使大白鼠代謝調控異常而導致體重減輕 (Andó et al., 1990)，因此，體重的改變可同時作為甲狀腺摘除成功的指標之一。. 23.

(32) 實驗 1-2 A. 實驗設計說明於實驗 1-1 中使用之大白鼠，於十二週齡 (P87) 犧牲取得血清後，依照前述 ELISA 方式測定 T3、T4 濃度，以確認是否成功建立甲狀腺摘除之動物模式。. B. 實驗結果說明實驗結果如圖二、三所示。Tx 組血清中的 T3 濃度顯著低於 Sham 組 ( p = 0.0008) (圖二)；Tx 組血清中的 T4 濃度顯著低於 Sham 組 ( p = 0.0026) (圖三)。此結果顯示，摘除甲狀腺後，動物血清中 T3、T4 濃度皆會明顯的降低。由於甲狀腺摘除後，會影響甲狀腺素分泌與調節，因此由動物血清中 T3、T4 濃度降低，可證實甲狀腺摘除成功。. 24.

(33) 實驗 1-3 A. 實驗設計說明於實驗 1-1 中使用之大白鼠，在 P80~P83 時分別進行高架十字迷宮、自發性運動行為監測及強迫游泳之行為測試，以瞭解甲狀腺的摘除對於動物運動功能及行為表現的影響。實驗流程如下：. B. 實驗結果說明 1. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM) 實驗結果如圖四所示。兩組動物在 (a) 進出開放臂次數未達統計上的顯著差異 ( p = 0.2535)，在 (b) 開放臂停留時間上也未達顯著差異 ( p = 0.0862)，顯示甲狀腺摘除與否，對動物行為焦慮程度的影響不明顯。. 25.

(34) 2. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM) 實驗結果如圖五所示，兩組動物的平均水平移動距離未達統計上之顯著差異 ( p = 0.2881)。此結果顯示，甲狀腺摘除與否，不會改變大白鼠自發性運動行為的表現，可排除甲狀腺可能因影響運動能力而改變行為測試結果的結果。. 3. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST) 實驗結果如圖六所示。Tx 組在水中靜止不動的時間較 Sham 組長，統計上達顯著差異 ( p = 0.0282)。顯示摘除甲狀腺會使動物表現出類憂鬱行為。. 26.

(35) 實驗 1-4 A. 實驗設計說明於實驗 1-1 中使用之大白鼠，經實驗 1-3 行為測試後，於 P87 灌流取腦組織，再依照前述方法組織切片後以 IHC 方法進行 DCX 染色，計算在海馬迴 DG 中的 DCX+ 細胞數量，以評估神經新生現象的變化。. B. 實驗結果說明實驗結果如圖七所示。Tx 組在海馬迴 DG 的 DCX+ 細胞數量顯著較 Sham 組多 ( p = 0.0414)，顯示此摘除甲狀腺誘發之類憂鬱行為的產生主要因素並非海馬迴成體神經新生現象減少。. 27.

(36) ◆ 第二階段：第一階段實驗結果顯示，大白鼠在甲狀腺摘除後三週會表現類憂鬱行為，但並未如前人觀察到在 DG 的新生神經元有減少的現象，因此為進一步探討其憂鬱行為之可能機轉，進行了藥物投予。. 實驗 2-1 A. 實驗設計說明本實驗為藥物施用前測。使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，皆施予偽手術處理，並於手術後一週 (P65) 開始投藥至 P86。紀錄動物每週的體重變化，並於 P80~P83 進行 EPM、LM 及 FST 行為測試，以排除投予 fluoxetine 對動物生長及運動行為可能產生的影響。組別如下： Group 1：Saline 保留甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。 Group 2：Fluoxetine 保留甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。 28.

(37) 實驗流程如下：. B. 實驗結果說明 1. 體重 (Body weight) 實驗結果如圖八所示。Fluoxetine 組與 Saline 組之體重至 12 週 ( p = 0.246) 皆無顯著差異，表示單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對動物體重變化有顯著影響。. 2. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM) 實驗結果如圖九所示。兩組動物在進出開放臂次數 (圖 a.) 未達統計上的顯著差異 ( p = 0.1562)，在開放臂停留時間 (圖 b.) 上也未達顯著差異 ( p = 0.1826)，顯示單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對動物行為焦慮程度有影響，可排除投藥可能影響其運動能力而改變行為測試結果的結果。 29.

(38) 3. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM) 實驗結果如圖十所示。兩組動物的平均水平移動距離不達統計上之顯著差異 ( p = 0.2846)。此結果顯示，單獨投予該劑量之 fluoxetine 不會對大白鼠自發性運動行為表現有顯著影響，可排除投藥可能影響其運動能力而改變行為測試結果的結果。. 4. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST) 實驗結果如圖十一所示。兩組動物的靜止不動時間未達統計上之顯著差異 ( p = 0.9757)。顯示單獨投予該劑量的 fluoxetine 不會對大白鼠表現靜止不動時間有顯著影響。. 30.

(39) 實驗 2-2 A. 實驗設計說明本實驗使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，再依前述手術處理。紀錄並比較 P58~P87 動物每週的體重變化，以了解摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 對生長的影響。組別如下： Group 1：Sham + Saline 保留甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。 Group 2：Thyroidectomy + Saline (Tx + Saline) 摘除甲狀腺，接受 saline 腹腔注射。 Group 3：Thyroidectomy + Fluoxetine (Tx + Fluoxetine) 摘除甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。. 31.

(40) B. 實驗結果說明實驗結果如圖十二所示，Tx + Saline 組的體重在手術後逐週降低，且在 11 週 ( p = 0.0086 ) 時與 Sham + Saline 組達統計上顯著差異；而 Tx + Fluoxetine 組的體重也在手術後逐週降低，並在 11 週 ( p = 0.0086 ) 時與 Sham + Saline 組達統計上顯著差異，但 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組至 12 週 ( p = 0.8358 ) 皆未有顯著差異。上述結果顯示，摘除甲狀腺後無論是否投予 fluoxetine，皆會對動物的體重變化有顯著的影響，並證實手術成功。. 32.

(41) 實驗 2-3 A. 實驗設計說明於實驗 2-2 中使用的大白鼠，於 P87 犧牲取得血清後，依照前述 ELISA 方式測定 T3、T4 濃度，以確認是否成功建立甲狀腺摘除之動物模式。. B. 實驗結果說明實驗結果如圖十三、十四所示。Tx + Saline 組血清中的 T3 濃度顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Fluoxetine 組血清中的 T3 濃度也顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Saline 組與 Tx + Fluoxetine 組則無顯著差異 ( p = 0.2839) (圖十三)。 Tx + Saline 組血清中的 T4 濃度顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Fluoxetine 組血清中的 T4 濃度也顯著低於 Sham + Saline 組 ( p < 0.0001 )；Tx + Saline 組與 Tx + Fluoxetine 組則無顯著差異 ( p = 0.604 ) (圖十四)。此結果顯示，摘除甲狀腺後無論是否投予 fluoxetine，動物血清中 T3、T4 濃度皆有明顯的降低，且不因投予 fluoxetine 而回復，同時證實甲狀腺摘除成功。. 33.

(42) 實驗 2-4 A. 實驗設計說明於實驗 2-2 中使用的大白鼠，在 P80~P83 時分別進行 EPM、 LM 及 FST 之行為測試，以瞭解摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 對於動物運動功能及行為表現的影響。實驗流程如下：. B. 實驗結果說明 1. 高架十字迷宮 (Elevated plus maze, EPM) 實驗結果如圖十五所示。Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 (a) 進出開放臂次數 ( p = 0.9695) 及 (b) 開放臂停留時間 ( p = 0.8647) 皆未達統計上顯著差異。此結果顯示，摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 不會對動物行為焦慮程度的改變有顯著影響。. 34.

(43) 2. 自發性運動行為 (Locomotor activity, LM) 實驗結果如圖十六所示。Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組的平均水平移動距離 ( p = 0.8603) 未達統計上顯著差異，顯示摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 對大白鼠自發性運動行為的表現不會有明顯的影響，可排除處理可能影響運動能力而改變行為測試結果的結果。. 3. 強迫游泳測試 (Forced swimming test, FST) 實驗結果如圖十七所示。Sham + Saline 組與 Tx + Saline 組的靜止不動時間有顯著差異 ( p = 0.0043)，且 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組的靜止不動時間也有顯著差異 ( p = 0.0021)；而 Tx + Fluoxetine 組與 Sham + Saline 組的靜止不動時間則無統計上顯著差異 ( p = 0.9166)。此結果顯示，投予 fluoxetine 能改善甲狀腺摘除之大白鼠出現的憂鬱行為，且回復之行為表現與未摘除者表現無異。. 35.

(44) 實驗 2-5 A. 實驗設計說明於實驗 2-2 中使用的大白鼠，在行為測試結束後 P87 進行灌流犧牲取腦組織，並依照前述 IHC 方法進行 DCX 染色，以人工計算在海馬迴 DG 中的 DCX+ 細胞數，另以 Metamorph 軟體分析 DCX+ 細胞分枝數，以評估神經新生現象的改變。. B. 實驗結果說明 1. DCX+ 細胞數 (Number of DCX-positive cells) 實驗結果如圖十八、十九所示。Tx + Saline 組與 Sham + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞數未達顯著差異 ( p = 0.8757)，但 Tx + Saline 組 DCX+ 細胞平均數量有較 Sham + Saline 組多的現象。而 Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞數量也未達顯著差異 ( p = 0.7637) (圖十九)。此結果顯示，大白鼠之神經新生現象在長期腹腔注射後，新生細胞數量可能與甲狀腺有無和投予 fluoxetine 與否無顯著相關。. 36.

(45) 2. DCX+ 細胞分枝數 (Dendritic branches of DCX-positive cells) 實驗結果如圖二十、二十一所示。 Tx + Saline 組與 Sham + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞分枝數未達顯著差異 ( p = 0.7025)，Tx + Fluoxetine 組與 Tx + Saline 組在 DG 的 DCX+ 細胞分枝數也未達顯著差異 ( p = 0.664) (圖二十一)。此結果顯示，大白鼠之新生細胞分枝在長期腹腔注射後，不論投藥與否皆與甲狀腺的摘除和投予 fluoxetine 無顯著相關。. 37.

(46) ◆ 第三階段：第二階段實驗結果顯示，大白鼠摘除甲狀腺後表現的類憂鬱行為可藉由 fluoxetine 有效改善，但在 DG 的未成熟神經元表現仍無差異。因此，進行此階段實驗，探討 fluoxetine 改善去甲狀腺大白鼠類憂鬱行為可能的作用機轉。 A. 實驗設計說明本實驗使用 P58 Wistar 雄性大白鼠，於手術前按體重均分，再依前述手術處理，投藥處理組在 P65~P86 間每日投藥。於 P87 犧牲取海馬迴 (hippocampus) 與縫核 (raphe nuclei) 之腦組織，依前述方法進行 RT-PCR 後，利用膠體電泳分析目前被認為與憂鬱較相關之 5-HT1A、5-HT2C (Lanfumey et al., 2008)、5-HT2A (Celada et al., 2004) 和 5-HT3A (Rajkumar and Mahesh, 2010) 受器的表現量，以了解摘除甲狀腺後投予 fluoxetine 之行為回復的可能機制。組別如下： Group 1：Sham 保留甲狀腺。 Group 2：Thyroidectomy (Tx) 摘除甲狀腺。. 38.

(47) Group 3：Thyroidectomy + Fluoxetine (Tx + Fluoxetine) 摘除甲狀腺，接受 fluoxetine 腹腔注射。. B. 實驗結果說明 1. 實驗結果如圖二十二所示。5-HT1A 受器 cDNA 在海馬迴的表現量， Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.2848)，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.1102)，但 Tx + Fluoxetine 組表現量有減少趨勢，且顯著較 Tx 組少 ( p = 0.0067)；另外，5-HT1A 受器 cDNA 在縫核中，Tx 組的表現量則顯著多於 Sham 組 ( p = 0.0247)，但 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組 ( p = 0.349) 和 Tx 組 ( p = 0.2585) 皆無顯著差異。此結果顯示，大白鼠縫核的 5-HT1A 受器分布改變，可能與甲狀腺摘除處理有關聯，而合併投予 fluoxetine 可能會影響 5-HT1A 受器在海馬迴的表現量。. 2. 實驗結果如圖二十三所示。5-HT2A 受器 cDNA 在海馬迴的表現量， Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.9998 )，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.9885)；另外，5-HT2A 受器 cDNA 在縫核中的表現量，Tx 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.8366)，但 39.

(48) Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.3165)。此結果顯示，大白鼠海馬迴和縫核 5-HT2A 受器的表現量可能與甲狀腺摘除無顯著的相關性。. 3. 實驗結果如圖二十四所示。5-HT2C 受器 cDNA 在海馬迴的表現量， Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.2621 )，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.126)；另外，5-HT2C 受器 cDNA 在縫核中的表現量，Tx 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.9991)，但 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.1889)。此結果顯示，大白鼠海馬迴和縫核 5-HT2C 受器的表現量可能與甲狀腺摘除無顯著的相關性。. 4. 實驗結果如圖二十五所示。5-HT3A 受器 cDNA 在海馬迴的表現量， Tx 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.9985 )，且 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.8174)；另外，5-HT3A 受器 cDNA 在縫核中的表現量，Tx 組與 Sham 組也無顯著差異 ( p = 0.7669)，但 Tx + Fluoxetine 組與 Sham 組無顯著差異 ( p = 0.9857)。此結果顯示，大白鼠海馬迴和縫核 5-HT3A 受器的表現量可能與甲狀腺摘除無顯著的相關性。 40.

(49) 第四章. 討論. 本研究利用甲狀腺摘除大鼠之動物模式，探討甲狀腺功能異常動物，產生類憂鬱行為之生理機轉；並測試投予百憂解對此種類憂鬱行為的可能療效及其作用機制。前人的研究藉由動物實驗及臨床測試，提出多種假說，以解釋因甲狀腺功能異常所引發之非典型憂鬱症 (atypical depression)，其可能之致病機轉，其中包括成體海馬迴神經新生作用 (Santarelli et al., 2003) 受到干擾；與血清素神經傳導物之釋放與作用調控異常等 (Bauer et al., 2002; Araya et al., 2012)，皆被認為可能與甲狀腺功能異常，併發非典型憂鬱症有關。本研究之目的為釐清兩者在致病過程中，何者扮演較關鍵的角色。本研究第一階段為建立甲狀腺功能異常之動物模式。對 8 週齡成年 Wistar 公鼠行甲狀腺摘除手術，並連續觀察其手術後至犧牲前的體重變化。與正常大鼠相比較，甲狀腺摘除組大鼠的體重會顯著減少 (圖一)，顯示手術能成功造成甲狀腺功能異常，根據前人的研究，甲狀腺摘除造成之體重下降，其機轉可能因甲狀腺缺失，影響代謝功能及內分泌調控，導致甲狀腺摘除之大鼠體重增長較緩慢 (Escobar-Morreale et al., 1997)。為進一步確認手術的效果，研究中並合併 ELISA 方法測定大鼠血清中 T3、T4 濃度，確認甲狀腺摘除之大鼠血液中 T3、T4 量顯著低於正常大鼠 (圖二和三)，其變化量與 41.

(50) 前人 (Redei et al., 2001) 的實驗結果相似。藉由上述兩項實驗結果與前人成年大鼠甲狀腺摘除模式，均呈現相似的生理變化，證明此動物模式能成功地模擬人類之甲狀腺功能異常。後續的行為測試發現甲狀腺摘除後，動物在高架十字迷宮 (圖四) 與自發性運動 (圖五) 之行為表現不受影響，但會使大鼠在 FST 的靜止不動時間顯著增加 (圖六)，顯示甲狀腺摘除後三週，大鼠會出現類憂鬱行為，且可排除此種行為變化，是由於甲狀腺摘除影響動物運動能力，或因焦慮行為增加，特別是焦慮所導致的呆滯反應 (freezing) 等非專一性效應 (non-specific effect)，所造成之實驗結果誤判。先前有研究指出成體海馬迴內神經新生作用之減少與憂鬱症成因有關，在本研究第一階段之組織免疫染色實驗結果卻顯現，甲狀腺摘除並表現類憂鬱行為之大鼠，其 DG 未成熟神經元數量顯著較正常大鼠多 (圖七)，第二階段中甲狀腺摘除並表現類憂鬱行為之大鼠 DG 未成熟神經元平均數量也有較正常多的現象 (圖十九)，此二結果的差異可能是 n 值不足或多加了腹腔注射投藥造成一長期壓力的變因而造成，但皆相異於 Montero-Pedrazuela 等人在甲狀腺摘除之成年大鼠中觀察到的海馬迴 DG 神經新生減少的現象，探究其可能原因有如下兩點：(1) 動物模式不盡相同：在文獻的實驗中，會在甲狀腺摘除後持續給予大鼠低碘食物及飲水中加入 0.02 % 的甲狀腺素抑 42.

(51) 制藥物 methimazole (MMI)，以此方法將大鼠體內甲狀腺素降至極低濃度 (serum T4 < 1.1 ng/mL; T3 < 0.08 ng/mL)。雖然，上述處理方式能更有效降低體內甲狀腺素濃度，但卻無法排除低碘食物及 MMI 可能造成其他生理功能的影響，且此生活條件與現實環境差異大，故於本研究中不予執行。因此，術後藥物處理之差異為其中一項可能原因。 (2) 實驗動物年齡不同：文獻中所使用動物為 P75 執行手術，P95 及 P120 進行行為測試及組織免疫染色觀察，與本實驗進行手術、行為測試及犧牲之時間點 (time point) 不同，故也可能因此造成與 Montero-Pedrazuela 等人實驗結果的差異。然綜觀本研究結果，雖在成體海馬迴 DG 的神經新生現象結果不同於前人，但動物在摘除甲狀腺後三週的 FST 中依然表現明顯的類憂鬱行為，因此可排除此類憂鬱行為的產生主因是海馬迴 DG 神經新生減少，而此結果也與近年對「神經性起源假說」提出質疑的文獻相呼應 (Holick et al., 2008; Jayatissa et al., 2010; Eisch and Petrik, 2012)。因此，為進一步探討此類憂鬱行為產生之原因，進行第二階段的實驗。由於 fluoxetine 對許多臨床的憂鬱行為有顯著療效，目前被廣泛用作治療多種不同類型的情感性精神疾病，而作用原理又與血清素神經傳導物有關，於是本研究以 fluoxetine 作為治療藥劑，藉以觀察血清素在此動物模式的類憂鬱行為表現上可能扮演的角色。在此階段實 43.

(52) 驗，主要先建立甲狀腺功能異常誘發類憂鬱行為的動物模式，再對甲狀腺摘除大鼠投予 fluoxetine，並觀察比較藥物投予後的行為變化及海馬迴 DG 的神經新生現象。首先，先進行藥物測試，以甲狀腺正常大鼠投予 fluoxetine，測試此劑量之藥物投予對正常動物可能的影響。結果顯示，投予 fluoxetine 對大鼠體重變化 (圖八) 及行為測試結果 (圖九~十一) 無顯著影響。接著，正式進行第二階段實驗，結果顯示不論投藥與否，甲狀腺摘除大鼠之體重變化 (圖十二)、在血液中 T3、T4 濃度變化 (圖十三、十四) 皆與第一階段結果相似，由此確認手術進行成功，且投予 fluoxetine 後不會使體重及血液中 T3、 T4 濃度改變回復，可排除藥物效果是藉由直接影響體內殘留的 THs 相關調控作用。在高架十字迷宮 (圖十五) 與自發性運動 (圖十六) 行為的測試也顯示，投予 fluoxetine 對甲狀腺摘除大鼠的運動能力及焦慮程度無顯著影響。但是，甲狀腺摘除大鼠在持續 17 天腹腔投予 fluoxetine 後，在 FST 中不會有顯著的類憂鬱行為表現 (圖十七)，且靜止不動時間幾近正常個體。組織免疫染色結果則顯示，各組處理在海馬迴 DG 上的未成熟神經元表現及其樹突分枝數皆無顯著差異 (圖十九、二十一)。如前述，近年文獻多導向成體海馬迴神經新生現象非憂鬱症形成的關鍵，如：阻斷成體神經新生並非都會造成類憂鬱症狀出現 (Jayatissa et al., 2010)；壓力也不一定能導致神經新生減少 44.

(53) (Lagace et al., 2010)。而一直以來，使用 SSRI 造成的神經新生現象都只單獨出現在 DG，卻不會影響 SVZ 的神經新生 (Boldrini et al., 2012)，也讓許多文獻對 SSRI 抗憂鬱藥物治療機轉，主要依賴神經新生現象的說法產生質疑。由此階段結果確認，甲狀腺功能異常引發之類憂鬱行為可藉由 SSRI 藥物 fluoxetine 來改善，但卻未顯著影響海馬迴 DG 的新生細胞數量，可能主要調控路徑非透過 DG 的成體神經新生現象，而是與血清素相關受器調控有關，遂進行第三階段實驗。第三階段實驗主要是為了探討造成第二階段 FST 結果的可能作用機轉。甲狀腺素與神經傳導物質相關系統的交互作用異常可能造成情緒異常，尤其甲狀腺素與血清素分泌量及相關受器調控皆在動物實驗中被發現，如：甲狀腺素會使縫核 5-HT1A 自體調控受器敏感度降低，而可能導致血清素的釋放量和作用程度增加 (Bauer et al., 2002)。在大腦的縫核是血清素神經元 (serotonergic neurons) 主要分布區域，而海馬迴是相關訊號投射路徑之一 (Barnes and Sharp, 1999)，因此，在第三階段實驗中，即利用 RT-PCR 分別定量縫核及海馬迴組織中 5-HT1A、5-HT2A、5-HT2C、5-HT3A 受器的表現量。由實驗結果可知，其中獨 5-HT1A 受器的表現量改變最顯著。在縫核中，甲狀腺摘除大鼠的 5-HT1A 受器表現量有顯著增加的現象，而甲狀腺摘除並投予 45.

(54) fluoxetine 的大鼠，雖表現量有較未投藥的摘除組少，但未達顯著；另外，在海馬迴中，甲狀腺摘除與否雖對 5-HT1A 受器的表現量無顯著的影響，但甲狀腺摘除並投予 fluoxetine 的大鼠 5-HT1A 受器卻顯著減少 (圖二十二)。根據前人研究，5-HT1A 受器在腦中不同區域有功能異質性，為血清素系統調控的關鍵，並與情緒異常表現有密切的關連。在縫核中的 5-HT1A 受器主要在突觸前神經元，為一自體調控受器 (autoreceptor) 可幫助負回饋調控縫核中血清素神經元的分泌 (Pineyro and Blier, 1999)，在臨床被診斷為憂鬱症自殺的患者檢體中發現，其縫核中 5-HT1A 受器密度會較正常人高 (Stockmeier et al., 1998)；相對的，5-HT1A 受器在邊緣系統及皮質區主要位於突觸後神經元上，可接收並傳遞抑制型的神經訊號，被認為能幫助調節減低害怕及焦慮情緒反應 (Chalmers and Watson, 1991; Pompeiano et al., 1992)。綜合前人及本實驗結果推測，可能為 THs 減低誘發縫核中 5-HT1A 受器表現量增多，進而促使中樞血清素釋放量減少進而導致憂鬱行為產生。另外，過去文獻也發現長期投予 fluoxetine 可能會導致中樞神經元的 5-HT1A 受器去敏感化 (desensitization) (Lanfumey et al., 2008)，因此，本實驗中投予 fluoxetine 之甲狀腺摘除大鼠憂鬱行為的消除，可能與海馬迴 5-HT1A 受器表現量下降有關，也可能是縫核 5-HT1A 受器去敏感化，使 5-HT1A 受器表現量雖增加但實為反應降低，其中確切的 46.

(55) 作用路徑有待進一步的研究與探討。. 47.

(56) 參考文獻 Abrous DN, Koehl M, Le Moal M. 2005. Adult neurogenesis: from precursors to network and physiology. Physiol Rev 85: 523-69 Airan RD, Meltzer LA, Roy M, Gong Y, Chen H, Deisseroth K. 2007. High-speed imaging reveals neurophysiological links to behavior in an animal model of depression. Science 317: 819-23 Altamura AC, Moro AR, Percudani M. 1994. Clinical pharmacokinetics of fluoxetine. Clin Pharmacokinet 26: 201-14 Altshuler LL, Bauer M, Frye MA, Gitlin MJ, Mintz J, Szuba MP, Leight KL, Whybrow PC. 2001. Does thyroid supplementation accelerate tricyclic antidepressant response? A review and meta-analysis of the literature. Am J Psychiatry 158: 1617-22 Ambrogini P, Cuppini R, Ferri P, Mancini C, Ciaroni S, Voci A, Gerdoni E, Gallo G. 2005. Thyroid hormones affect neurogenesis in the dentate gyrus of adult rat. Neuroendocrinology 81: 244-53 Andó S, Panno ML, Beraldi E, Tarantino G, Salerno M, Palmero S, Prati M, Fugassa E. 1990. Influence of hypothyroidism on in-vitro testicular steroidogenesis in adult rats. Exp Clin Endocrinol 96: 149-56 Andrade TG, Macedo CE, Zangrossi H, Jr., Graeff FG. 2004. Anxiolytic-like effects of median raphe nucleus lesion in the elevated T-maze. Behav Brain Res 153: 55-60 Araya AV, Massardo T, Fiedler J, Risco L, Quintana JC and Liberman C. 2012. Depressive disorders and thyroid function. Ward LS (ed). Thyroid and Parathyroid Diseases - New Insights into Some Old 48.

(57) and Some New Issues, pp. 259-78 Aronson R, Offman HJ, Joffe RT, Naylor CD. 1996. Triiodothyronine augmentation in the treatment of refractory depression. A meta-analysis. Arch Gen Psychiatry 53: 842-8 Asberg M, Thoren P, Traskman L, Bertilsson L, Ringberger V. 1976. "Serotonin depression": A biochemical subgroup within the affective disorders? Science 191: 478-80 Barnes NM and Sharp T. 1999. A review of central 5-HT receptors and their function. Neuropharmacology 38: 1083-152 Bauer M, Heinz A, Whybrow PC. 2002. Thyroid hormones, serotonin and mood: of synergy and significance in the adult brain. Mol Psychiatry 7: 140-56 Baumgartner A. 2000. Thyroxine and the treatment of affective disorders: an overview of the results of basic and clinical research. Int J Neuropsychopharmacol 3: 149-65 Becker S and Wojtowicz JM. 2007. A model of hippocampal neurogenesis in memory and mood disorders. Trends Cogn Sci 11: 70-6 Berton O and Nestler EJ. 2006. New approaches to antidepressant drug discovery: beyond monoamines. Nat Rev Neurosci 7: 137-51 Blier P and de Montigny C. 1994. Current advances and trends in the treatment of depression. Trends Pharmacol Sci 15: 220-6 Blier P, de Montigny C, Chaput Y. 1987. Modifications of the serotonin system by antidepressant treatments: implications for the therapeutic response in major depression. J Clin Psychopharmacol 7: 24S-35S 49.

(58) Boldrini M, Hen R, Underwood MD, Rosoklija GB, Dwork AJ, Mann JJ, Arango V. 2012. Hippocampal angiogenesis and progenitor cell proliferation are increased with antidepressant use in major depression. Biol Psychiatry 72: 562-71 Campbell S, Marriott M, Nahmias C, MacQueen GM. 2004. Lower hippocampal volume in patients suffering from depression: a meta-analysis. Am J Psychiatry 161: 598-607 Carroll BJ, Martin FI, Davies B. 1968. Resistance to suppression by dexamethasone of plasma 11-O.H.C.S. levels in severe depressive illness. Br Med J 3: 285-7 Celada P, Puig M, Amargos-Bosch M, Adell A, Artigas F. 2004. The therapeutic role of 5-HT1A and 5-HT2A receptors in depression. J Psychiatry Neurosci 29: 252-65 Chalmers DT and Watson SJ. 1991. Comparative anatomical distribution of 5-HT1A receptor mRNA and 5-HT1A binding in rat brain--a combined in situ hybridization/ in vitro receptor autoradiographic study. Brain Res 561: 51-60 Chan S and Kilby MD. 2000. Thyroid hormone and central nervous system development. J Endocrinol 165: 1-8 Christie BR and Cameron HA. 2006. Neurogenesis in the adult hippocampus. Hippocampus 16: 199-207 Courtin F, Chantoux F, Francon J. 1988. Thyroid hormone metabolism in neuron-enriched primary cultures of fetal rat brain cells. Mol Cell Endocrinol 58: 73-84 de Escobar GM, Obregon MJ, del Rey FE. 2004. Maternal thyroid hormones early in pregnancy and fetal brain development. Best 50.

(59) Pract Res Clin Endocrinol Metab 18: 225-48 Delgado PL, Price LH, Miller HL, Salomon RM, Aghajanian GK, Heninger GR, Charney DS. 1994. Serotonin and the neurobiology of depression. Effects of tryptophan depletion in drug-free depressed patients. Arch Gen Psychiatry 51: 865-74 Demartini B, Masu A, Scarone S, Pontiroli AE, Gambini O. 2010. Prevalence of depression in patients affected by subclinical hypothyroidism. Panminerva Med 52: 277-82 Desouza LA, Ladiwala U, Daniel SM, Agashe S, Vaidya RA, Vaidya VA. 2005. Thyroid hormone regulates hippocampal neurogenesis in the adult rat brain. Mol Cell Neurosci 29: 414-26 Dietrich JW, Landgrafe G, and Fotiadou EH. 2012. TSH and Thyrotropic Agonists: Key Actors in Thyroid Homeostasis. J Thyroid Res 2012: 351864 Eisch AJ and Petrik D. 2012. Depression and hippocampal neurogenesis: a road to remission? Science 338: 72-5 Eravci M, Pinna G, Meinhold H, Baumgartner A. 2000. Effects of pharmacological and nonpharmacological treatments on thyroid hormone metabolism and concentrations in rat brain. Endocrinology 141: 1027-40 Ernst C, Olson AK, Pinel JP, Lam RW, Christie BR. 2006. Antidepressant effects of exercise: evidence for an adult-neurogenesis hypothesis? J Psychiatry Neurosci 31: 84-92 Escobar-Morreale HF, Escobar del Rey F, Morreale de Escobar G. 1997. Thyroid hormones influence serum leptin concentrations in the rat. Endocrinology 138: 4485-8 51.

(60) Gibbons RD, Hur K, Brown CH, Davis JM, Mann JJ. 2012. Benefits from antidepressants: synthesis of 6-week patient-level outcomes from double-blind placebo-controlled randomized trials of fluoxetine and venlafaxine. Arch Gen Psychiatry 69: 572-9 Goodwin FK and Post RM. 1983. 5-hydroxytryptamine and depression: a model for the interaction of normal variance with pathology. Br J Clin Pharmacol 15 Suppl 3: 393S-405S Gould NF, Holmes MK, Fantie BD, Luckenbaugh DA, Pine DS, Gould TD, Burgess N, Manji HK, Zarate CA, Jr. 2007. Performance on a virtual reality spatial memory navigation task in depressed patients. Am J Psychiatry 164: 516-9 Gross CG. 2000. Neurogenesis in the adult brain: death of a dogma. Nat Rev Neurosci 1: 67-73 Heinz A, Ragan P, Jones DW, Hommer D, Williams W, Knable MB, Gorey JG, Doty L, Geyer C, Lee KS, Coppola R, Weinberger DR, Linnoila M. 1998. Reduced central serotonin transporters in alcoholism. Am J Psychiatry 155: 1544-9 Heisler LK, Chu HM, Brennan TJ, Danao JA, Bajwa P, Parsons LH, Tecott LH. 1998. Elevated anxiety and antidepressant-like responses in serotonin 5-HT1A receptor mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 15049-54 Holick KA, Lee DC, Hen R, Dulawa SC. 2008. Behavioral effects of chronic fluoxetine in BALB/cJ mice do not require adult hippocampal neurogenesis or the serotonin 1A receptor. Neuropsychopharmacol 33: 406-17 Jayatissa MN, Henningsen K, Nikolajsen G, West MJ, Wiborg O. 2010. 52.

(61) A reduced number of hippocampal granule cells does not associate with an anhedonia-like phenotype in a rat chronic mild stress model of depression. Stress 13: 95-105 Jha S, Dong B, Sakata K. 2011. Enriched environment treatment reverses depression-like behavior and restores reduced hippocampal neurogenesis and protein levels of brain-derived neurotrophic factor in mice lacking its expression through promoter IV. Transl Psychiatry 1: e40 Jobe PC, Dailey JW, Wernicke JF. 1999. A noradrenergic and serotonergic hypothesis of the linkage between epilepsy and affective disorders. Crit Rev Neurobiol 13: 317-56 Kansagra SM, McCudden CR, Willis MS. 2010. The challenges and complexities of thyroid hormone replacement. Lab Med 41: 338-48 Knoth R, Singec I, Ditter M, Pantazis G, Capetian P, Meyer RP, Horvat V, Volk B, Kempermann G. 2010. Murine features of neurogenesis in the human hippocampus across the lifespan from 0 to 100 years. PLoS One 5: e8809 Kulikov A, Torresani J, Jeanningros R. 1997. Experimental hypothyroidism increases immobility in rats in the forced swim paradigm. Neurosci Lett 234: 111-4 Lagace DC, Donovan MH, DeCarolis NA, Farnbauch LA, Malhotra S, Berton O, Nestler EJ, Krishnan V, Eisch AJ. 2010. Adult hippocampal neurogenesis is functionally important for stress-induced social avoidance. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 4436-41 Lanfumey L, Mongeau R, Cohen-Salmon C, Hamon M. 2008. 53.

(62) Corticosteroid-serotonin interactions in the neurobiological mechanisms of stress-related disorders. Neurosci Biobehav Rev 32: 1174-84 Lledo PM, Alonso M, Grubb MS. 2006. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat Rev Neurosci 7: 179-93 MacQueen GM, Campbell S, McEwen BS, Macdonald K, Amano S, Joffe RT, Nahmias C, Young LT. 2003. Course of illness, hippocampal function, and hippocampal volume in major depression. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1387-92 Madeira MD, Cadete-Leite A, Andrade JP, Paula-Barbosa MM. 1991. Effects of hypothyroidism upon the granular layer of the dentate gyrus in male and female adult rats: a morphometric study. J Comp Neurol 314: 171-86 Maes M and Meltzer HY. 1995. The serotonin hypotheses of major depression. In: Bloom FE, Kupfer DJ (eds). Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progess. New York: Raven Press, pp. 933-44 Malberg JE, Eisch AJ, Nestler EJ, Duman RS. 2000. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci 20: 9104-10 Malison RT, Price LH, Berman R, van Dyck CH, Pelton GH, Carpenter L, Sanacora G, Owens MJ, Nemeroff CB, Rajeevan N, Baldwin RM, Seibyl JP, Innis RB, Charney DS. 1998. Reduced brain serotonin transporter availability in major depression as measured by [123I]-2 beta-carbomethoxy-3 beta-(4-iodophenyl)tropane and 54.

(63) single photon emission computed tomography. Biol Psychiatry 44: 1090-8 Markou K, Georgopoulos N, Kyriazopoulou V, Vagenakis AG. 2001. Iodine-Induced hypothyroidism. Thyroid 11: 501-10 Mayberg HS, Brannan SK, Tekell JL, Silva JA, Mahurin RK, McGinnis S, Jerabek PA. 2000. Regional metabolic effects of fluoxetine in major depression: serial changes and relationship to clinical response. Biol Psychiatry 48: 830-43 McEwen BS. 2003. Mood disorders and allostatic load. Biol Psychiatry 54: 200-7 Miller KJ, Parsons TD, Whybrow PC, Van Herle K, Rasgon N, Van Herle A, Martinez D, Silverman DH, Bauer M. 2007. Verbal memory retrieval deficits associated with untreated hypothyroidism. J Neuropsychiatry Clin Neurosci 19: 132-6 Mirescu C and Gould E. 2006. Stress and adult neurogenesis. Hippocampus 16: 233-8 Montero-Pedrazuela A, Venero C, Lavado-Autric R, Fernandez-Lamo I, Garcia-Verdugo JM, Bernal J, Guadano-Ferraz A. 2006. Modulation of adult hippocampal neurogenesis by thyroid hormones: implications in depressive-like behavior. Mol Psychiatry 11: 361-71 Morreale de Escobar G, Obregon MJ, Ruiz de Ona C, Escobar del Rey F. 1988. Transfer of thyroxine from the mother to the rat fetus near term: effects on brain 3,5,3'-triiodothyronine deficiency. Endocrinology 122: 1521-31 Moser MB and Moser EI. 1998. Functional differentiation in the 55.

(64) hippocampus. Hippocampus 8: 608-19 Nease DE, Jr. and Maloin JM. 2003. Depression screening: a practical strategy. J Fam Pract 52: 118-24 Nilsson M, Perfilieva E, Johansson U, Orwar O, Eriksson PS. 1999. Enriched environment increases neurogenesis in the adult rat dentate gyrus and improves spatial memory. J Neurobiol 39: 569-78 Obregon MJ, Mallol J, Pastor R, Escobar GMD, Rey FED. 1984. L-thyroxine and 3,5,3’-triiodo-L-thyronine in rat embryos before onset of fetal thyroid function. Endocrinology 114: 305-07 Olivares EL, Silva-Almeida C, Pestana FM, Sonoda-Cortes R, Araujo IG, Rodrigues NC, Mecawi AS, Cortes WS, Marassi MP, Reis LC, Rocha FF. 2012. Social stress-induced hypothyroidism is attenuated by antidepressant treatment in rats. Neuropharmacology 62: 446-56 Rajkumar R and Mahesh R. 2010. The auspicious role of the 5-HT3 receptor in depression: a probable neuronal target? J Psychopharmacol 24: 455-69 Papakostas GI, Cooper-Kazaz R, Appelhof BC, Posternak MA, Johnson DP, Klibanski A, Lerer B, Fava M. 2009. Simultaneous initiation (coinitiation) of pharmacotherapy with triiodothyronine and a selective serotonin reuptake inhibitor for major depressive disorder: a quantitative synthesis of double-blind studies. Int Clin Psychopharmacol 24: 19-25 Paxinos G and Watson C. 1997. The rat brain in stereotaxic coordinates. New York: Academic Press 56.

(65) Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. 1985. Validation of open: closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Methods 14: 149-67 Pineyro G and Blier P. 1999. Autoregulation of serotonin neurons: role in antidepressant drug action. Pharmacol Rev 51: 533-91 Pompeiano M, Palacios JM, Mengod G. 1992. Distribution and cellular localization of mRNA coding for 5-HT1A receptor in the rat brain: correlation with receptor binding. J Neurosci 12: 440-53 Porsolt RD, Le Pichon M, Jalfre M. 1977. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature 266: 730-2 Prange AJ, Jr., Wilson IC, Rabon AM, Lipton MA. 1969. Enhancement of imipramine antidepressant activity by thyroid hormone. Am J Psychiatry 126: 457-69 Ramboz S, Oosting R, Amara DA, Kung HF, Blier P, Mendelsohn M, Mann JJ, Brunner D, Hen R. 1998. Serotonin receptor 1A knockout: an animal model of anxiety-related disorder. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 14476-81 Redei EE, Solberg LC, Kluczynski JM, Pare WP. 2001. Paradoxical hormonal and behavioral responses to hypothyroid and hyperthyroid states in the Wistar-Kyoto rat. Neuropsychopharmacol 24: 632-9 Samuels MH, Schuff KG, Carlson NE, Carello P, Janowsky JS. 2007. Health status, mood, and cognition in experimentally induced subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 92: 2545-51 Santarelli L, Saxe M, Gross C, Surget A, Battaglia F, Dulawa S, Weisstaub N, Lee J, Duman R, Arancio O, Belzung C, Hen R. 57.

(66) 2003. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science 301: 805-9 Sapolsky RM. 2000. Glucocorticoids and hippocampal atrophy in neuropsychiatric disorders. Arch Gen Psychiatry 57: 925-35 Scott BW, Wojtowicz JM, Burnham WM. 2000. Neurogenesis in the dentate gyrus of the rat following electroconvulsive shock seizures. Exp Neurol 165: 231-6 Seminowicz DA, Mayberg HS, McIntosh AR, Goldapple K, Kennedy S, Segal Z, Rafi-Tari S. 2004. Limbic-frontal circuitry in major depression: a path modeling meta-analysis. Neuroimage 22: 409-18 Siever LJ and Davis KL. 1985. Overview: toward a dysregulation hypothesis of depression. Am J Psychiatry 142: 1017-31 Singhal RL, Rastogi RB, Hrdina PD. 1975. Brain biogenic amines and altered thyroid function. Life Sci 17: 1617-26 Stockmeier CA, Shapiro LA, Dilley GE, Kolli TN, Friedman L, Rajkowska G. 1998. Increase in serotonin-1A autoreceptors in the midbrain of suicide victims with major depression-postmortem evidence for decreased serotonin activity. J Neurosci 18: 7394-401 Strawn JR, Ekhator NN, D'Souza BB, Geracioti TD, Jr. 2004. Pituitary-thyroid state correlates with central dopaminergic and serotonergic activity in healthy humans. Neuropsychobiology 49: 84-7 Tanaka K, Inada M, Ishii H, Naito K, Nishikawa M, Mashio Y, Imura H. 1981. Inner ring monodeiodination of thyroxine and 3,5,3'-L-triiodothyronine in rat brain. Endocrinology 109: 1619-24 Uchida K, Yonezawa M, Nakamura S, Kobayashi T, Machida T. 2005. 58.

(67) Impaired neurogenesis in the growth-retarded mouse is reversed by T3 treatment. Neuroreport 16: 103-6 Videbech P and Ravnkilde B. 2004. Hippocampal volume and depression: a meta-analysis of MRI studies. Am J Psychiatry 161: 1957-66 Vulsma T, Gons MH, de Vijlder JJ. 1989. Maternal-fetal transfer of thyroxine in congenital hypothyroidism due to a total organification defect or thyroid agenesis. N Engl J Med 321: 13-6 Weiss JM, Goodman PA, Losito BG, Corrigan S, Charry JM, Bailey WH. 1981. Behavioral depression produced by an uncontrollable stressor: Relationship to norepinephrine, dopamine, and serotonin levels in various regions of rat brain. Brain Res Brain Res Rev 3: 167-205 Wheatley D. 1972. Potentiation of amitriptyline by thyroid hormone. Arch Gen Psychiatry 26: 229-33 Whybrow PC, Prange AJ, Jr., Treadway CR. 1969. Mental changes accompanying thyroid gland dysfunction. A reappraisal using objective psychological measurement. Arch Gen Psychiatry 20: 48-63 Wilcoxon JS, Nadolski GJ, Samarut J, Chassande O, Redei EE. 2007. Behavioral inhibition and impaired spatial learning and memory in hypothyroid mice lacking thyroid hormone receptor alpha. Behav Brain Res 177: 109-16 Wilson IC, Prange AJ, Jr., McClane TK, Rabon AM, Lipton MA. 1970. Thyroid-hormone enhancement of imipramine in nonretarded depressions. N Engl J Med 282: 1063-7 Wiskott L, Rasch MJ, Kempermann G. 2006. A functional hypothesis for 59.

(68) adult hippocampal neurogenesis: avoidance of catastrophic interference in the dentate gyrus. Hippocampus 16: 329-43. 60.

(69) 附圖/表 Sham Tx. 450 400. Body weight ( g ). 350. *. *. 300 250 200 150 100 50 0 8. 9. 10. 11. 12. Age (wk). 圖一、動物體重測量紀錄表。摘除甲狀腺之 Tx 組體重 11 週始顯著低於未摘除甲狀腺之 Sham 組。數值以 Mean ± SEM 方式表示，各組 n 值為 5，以 Student’s t-test 與 Sham 組比較，*p < 0.05。. 61.