第一節 研究材料 中藥萃取
由順天堂公司分讓或由坊間購得之中藥藥材，以 9 克的藥材對 10 毫升的甲醇(Merck)的比 例，密封在 50 毫升離心管中，以室溫 100 rpm，搖晃萃取 48 小時後，移至-70℃冷凍 12 小時 後，再將中藥萃取液做無菌檢測;確認有無細菌生長後，以 0.45 µm 的濾膜(PALL)過濾，去除 微生物並加以分裝，另外取 1 毫升以 LABCONCO 的真空乾燥機，低溫乾燥以便估算? 重，
中藥萃取液的濃度以 ug/ul 表示在後來的大量藥物搜尋中，中藥萃取液以 1/1000(v/v)的體積，
以一倍的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(GIBCO) DMEM 稀釋，作為搜尋模式中所使用的 濃度。
第二節 細胞培養與純化合物蒐集
在本實驗中主要是利用 Chang liver/AP-1 和 HepG2/AP-1（賴，2001），來描述藥物對不同 癌化程度的人類肝細胞株中 AP-1 的影響;此外使用 HepG2/NF-?B 的重組細胞株（賴，2001），
測定藥物對肝細胞中 NF-?B 的影響，以含有 10 % 胎牛血清 (Hyclone)的 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(GIBCO) DMEM，培養於 37℃的培養箱中，LPS (Lipopolysaccharide from E. coli) 和 TPA 與黃酮類、多酚類等藥物購自 Sigma。LPS 以純水溶解，TPA 和黃酮類等藥物以絕對 酒精或甲醇溶解。
第三節 AP-1 與 NF-?B 的活性測定
的細胞溶解液，以 1:1 (v/v)的比例加入 Luciferase reagent (含 33.3 mM DTT，270 µM Coenzyme A, 530 µM ATP, 470 µM Luciferin (Firefly)), LAR (含 20 mM Tricine, pH 7.8, 1.07 mM
(MgCO3)4Mg(OH)2, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA)作用，以 FB15 Lumiometer 測定冷光強度;
單位以 RLU (Relative Light Unit)表示，代表細胞內加入藥物固定時間後轉錄因子的活性。
第四節 細胞活性測定 (MTT method)
把細胞培養在 96 孔盤，過了 24 小時後加入以 DMEM 稀釋的藥物作用在固定時間後，加 入 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)，作用 4 小時，加入 0.1 % SDS-HCl (含 10 mM HCl, 20% SDS)，24 小時後，以 570 nm 的波長測定吸光度的強弱，來代 表細胞的活性；吸光度越強代表細胞活性越佳，反之則否。藉此用來描述藥物對細胞活性的影 響。
第五節 西方點墨法 ( Western blot)
細胞在 25T flask 中，培養至全滿，移去上層之培養基後，加入以 DMEM 稀釋的藥物，作 用固定時間後把細胞放在冰上，? 止作用，並以冰冷的一倍 PBS 清洗；加入 SDS sample buffer (含 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% Glycerol, 50 mM DTT, 0.1% Bromophenol blue)，
溶解細胞，以超音波震盪器震盪 10 秒，擊碎細胞後，再以 4℃、12000 rpm、離心 5 分鐘後，
以 100℃煮沸 5 分鐘後，用含 10% polyacrylamide 的膠體做蛋白質電泳，並以硝酸纖維薄膜 ( Nitrocellulose paper, NC paper, Amersham®) 轉印，再加入用 Blocking buffer (含 1 倍 Tris buffer saline (TBS), 0.1% Tween-20, 5 % Non- fat dry milk)稀釋的抗 I-?B，phospho-I-?B 的抗體 (New England Biolab) 做雜合作用後，加入抗兔子的 IgG 抗體，最後以 ECL (Amersham®)呈色最後 以 X 光底片顯影。
第六節 細胞素的酵素連結免疫吸附法( Cytokine ELISA)
細胞以前述方式繼代和加藥後，過了固定時間吸取上層之培養基，以每一格 200 µl 的體 積加入作用盤中，接著使用 BD 的 OPtEIAT M human TNF-a 和 OPtEIATM human IL-1ß 套組，
以含有一倍 ABTS 的檸檬酸/磷酸緩衝液，作為受質，並以 405 nm 的波長測量吸光度;並以內 插法的方式計算出樣品的濃度，以 pg/mL 表示。
第七節 統計方法
本研究中使用 Excel XP (Microsoft®)計算多次重複實驗中數據的平均值與標準差，並利用 Student’s t test 分析有無顯著差異存在。另外藥物對誘發劑活化轉錄因子活性的影響，則以誘 發劑誘發細胞中轉錄因子活性的平均倍率為基準(1 倍)，以 Relative AP-1activity 或 Relative NF-?B activity 表示。