第一節 結果討論
近年來細胞的轉形的過程與轉錄因子之間的關係已經漸漸為人所了解，轉錄因子AP-1在細 胞生長分裂的過程中扮演重要的角色；在小鼠的上皮細胞株(JB6)中TPA或是Okadaic Acid等腫 瘤促進劑或EGF等生長因子，可以透過 (RTK)/Ras/Raf/PKC/MEK/MAPK的訊息傳導路線活化 AP-1 (Guangming et al., 2001；Ruchika et al., 2001； Liu et al., 2002； Eric et al., 2002；Liu et al., 2001)。此外為了了解小鼠上皮細胞在受到Okadaic acid、TPA等腫瘤促進劑刺激，導致細胞轉 形，主要透過MAPK中何種路徑活化；送入Dominant negative c-jun (TAM 67)到JB6細胞中，可 以抑制細胞的轉形(Eric et al., 2002)，並且促使一些受AP-1調控的基因被抑制。另外，當小鼠 體內缺乏c-Jun N-terminal Kinase-1(JNK-1)時，會使得TPA促進的皮膚癌的發生受到抑制 (Nanyue et al., 2002)。在實驗室之前的研究中發現：在不同癌化程度的肝細胞中，TPA主要會 透過ERK磷酸化的訊息傳導路線，促使細胞內AP-1的活性上升促進細胞內AP-1和DNA 的結合 能力提高最後導致Soft agar上細胞的轉形（賴，2001）。而B型肝炎的X蛋白質（X protein），或 C型肝炎的核心蛋白質（core protein）在基因轉殖鼠的體內表現時，會活化ERK和JNK的路徑 並造成和肝細胞增生相關的細胞素如：TNF-a、 IL-1ß、IL-6等基因表現，並伴隨肝實質癌症 的發生(Tsutsumi et al., 2002； Arsura et al., 2003)。為了了解肝癌的發生主要透過的訊息傳導 路線，加入對ERK上游蛋白質激? MEK-1專一性的抑制劑：PD98059則可抑制肝癌的發生 ( Ruchika et al., 2001)與TPA在促進肝細胞轉形的機轉是相近的。這也說明了使用TPA作為肝細 胞轉形的促進劑，作為相關藥物搜尋與新藥開發的可行性。在抗肝細胞轉形的藥物搜尋系統 中，可以觀察到某一些科別的植物具有抑制TPA誘發AP-1活性的趨勢，可能和這些植物所含有 的物質有關；例如：毛茛科（Ranunculaceae）、小檗科（Berberidaceae）的植物具有近源性，
其韌皮部含有以小檗鹼為核心的生物鹼類似物，可能是抑制肝細胞中AP-1活性的原因。另外 繖型科的植物：柴胡、當歸、羌活等也可以抑制TPA所誘發的AP-1活性，原因之一可能和此科
合，進入細胞核內和AP-1複合體產生相互拮抗的作用（Wu, 2003）。另外在不同科別的植物中，
含有同樣的活性物質，也是抑制AP-1活性的原因之一。例如毛茛科的黃連和芸香科的黃柏可 以抑制TPA所誘發的AP-1活性，而這兩種植物所共同含有的生物鹼－小檗鹼也有同樣的效果，
進一步說明了此搜尋系統的對於偵測微量物質的靈敏度。
轉錄因子NF-?B，與許多和發炎作用相關的細胞素基因的啟動有關，如：TNF-a、IL-6、
IL-1ß、IL-8、TGF-ß的啟動子區域，具有NF-?B的結合序列。一些物質；如細菌性內毒素LPS、
ceramide或是TNF-a等則會經由結合特定的接受器並經由PKC/Rac/NIK/IKK的訊息傳導路線，
促進I-?B的磷酸化和分離，並促使由細胞質進入到細胞核中。NF-?B的活化與肝病在體內的試 驗所呈現的相關性；報告中指出在臨床上已確定罹患肝癌的病人其發生病變的組織中，
NF-?B、AP-1與STAT等蛋白質與DNA結合能力比正常的肝組織高許多(Liu et a l., 2002)。另外，
酒精代謝物乙醛對HepG2細胞造成氧化傷害的作用中，會透過PKC的訊息傳導途徑，造成細胞 中AP-1和NF--?B的活化並使得這兩個轉錄因子與DNA的結合能力上升(Juan et al., 2000)，並且 會和HBV的X蛋白質與HCV的核心蛋白質產生協同作用，促進TNF--a的大量表現加重肝細胞 的炎症作用(Won et al., 2001)。在發炎性的細胞素中；TGF-ß會透過結合細胞膜表面TGF-ß的接 受器，啟動一連串訊息傳導路線，並使肝儲脂細胞分泌大量第一型膠原蛋白誘發肝纖維化的產 生(Chen et al., 2000；Border and Noble, 1994；Bedossa and Paradis, 1995)。此外TGF-ß的活化，
也會經TAK1/IKK 的訊息傳導路線，促進肝細胞中NF-?B的活化，並抑制經AP-1/SMAD活化 誘導的細胞自殺作用(Arsura et al., 2003)。 TNF-a 除了會導致細胞中NF-?B的活化，並經由與 TNF-a接受器結合，啟動JNK的訊息傳導路線，導致細胞凋亡作用的發生，也可能是肝臟產生 發炎的原因之一。酒精及其代謝物乙醛和細菌性內毒素LPS等，對肝細胞造成炎症作用，原因 為這些物質會促進細胞生產生長因子與細胞素 TNF-a 及IL-1ß 的產生(Lotz et al., 1989；
Friedman et al., 2000； Pennington et al., 1997)。在酒精性肝炎的組織和血清中也有類似的作 用。另外，金屬離子或H2O2等物質對肝細胞造成的氧化傷害作用中；也會觀測到TNF-a、IL-8
利用LPS誘發HepG2細胞中NF--?B的活性，作為抗肝細胞炎症作用的藥物大量搜尋模式，觀察 了500多種藥物的作用圖譜。從以上的大量搜尋得到的結果中發現一些藥物會同時抑制肝細胞 中AP-1與NF-?B的活性，其可能與植物中所含的物質，會同時干擾AP-1與NF-?B上游的的訊息 傳導路線有關。另外一些植物或純物質會抑制這兩個轉錄因子之一的活性，但對另一個沒有影 響，可能也與藥物中所含的活性物質的成份有關。
在抑制乙醛誘發 HepG2 細胞中 NF-?B 的活性的藥物搜尋之中，觀測到黃連、黃柏及小檗鹼具 有抑制乙醛誘發的 NF-?B 的活性，小檗鹼為毛茛科植物黃連或芸香科植物黃柏的根莖、或韌 皮部所分離的生物鹼。具有抑制癌細胞生長、抑制炎症作用、抗金黃色葡萄球菌抑制 TPA 誘 發的小鼠皮膚的發炎作用以及抗下痢的功能（Kuo et al., 1995；Yasukawa et al., 1991；Anis et al., 2001)對於四氯化碳所引起的齧齒類動物的肝纖維化（Janbaz and Gilani , 2000），和肝功能損 害，皆有治療的功能。另外在大鼠的巨噬細胞中，小檗鹼具有抑制革蘭氏陰性菌的脂多醣體
（Lipopolysaccharide, LPS）所誘發的 NF-?B 活化的功能;並且抑制 LPS 所誘發的 TNF-a 的表 現（Kang et al., 2002）。而在人類血癌細胞株中，小檗鹼具有促進細胞產生細胞凋亡的能力(Kuo et al., 1995)。
在此我們希望藉由相關的研究，了解小檗鹼在抑制酒精性肝炎發生的細胞模式中詳細的分子機 轉;並且為以後相關的新藥開發，提供一個更快速、高靈敏度的搜尋平台和療效指標。
由於小檗鹼為黃連等植物中之指標成份；在接續的實驗中，也發現小檗鹼對乙醛誘發 NF--?B的活性具有抑制的作用。對於炎症作用相關細胞素:TNF-a 及 IL-1ß的表現具有抑制的 功能。此外；小檗鹼會干擾細胞內I-?B磷酸化蛋白質的量，進一步抑制相關轉錄因子及下游基 因的表現。未來希望能夠了解小檗鹼是否會對轉錄因子與DNA的結合能力造成影響，並進一 步研究小檗鹼在體內是否也發揮同樣的生物活性。
第七章 結論與建議
第一節 結論
在本研究中，使用不同癌化程度的重組人類肝細胞株，偵測不同誘發劑誘發細胞中轉錄 因子活性，代表特定肝病模式。觀察藥物對AP-1與NF-?B的影響，並選擇具有抑制轉錄因子活 性，具新藥開發潛力的植物萃取物或化合物作為研究的目標。在諸多搜尋之中，小檗鹼具有抑 制乙醛誘發之NF-?B的活性，原因為其能干擾上游訊息傳導路線的活化，並抑制轉錄因子控制 下游基因的表現，對細胞生長造成抑制。希望藉由此模式作為未來研究的起點，進一步推展到 體內試驗，希望小檗鹼也可以發揮類似的功能
第二節 建議
未來將進一步研究小檗鹼和乙醛在分子生物學上對NF-?B的作用，了解NF-?B在此扮演的 角色，以及對被這兩個轉錄因子所調控的基因做研究，釐清作用發生的原因與結果，並推動相 關的動物實驗，觀察小檗鹼在生物體內產生的作用是否也能和體外的模式一樣具有類似的功 能，希望小檗鹼可以對肝病的預防和治療有所貢獻並且為未來新藥開發的過程提供一個良好的 範本。