第一節 TPA 可以誘發 Chang liver/AP-1 與 HepG2/AP-1 細胞中 AP-1 的活性
細胞在繼代到 96 孔盤後，待其生長到全滿；把生長環境中的血清去除，加入含 0.1 % 胎牛血清的一倍 DMEM，培養超過 24 小時稱為 starvation，目的是為了使細胞的細胞週期停 止在 G1 phase。另外，AP-1 為一個受血清調控的因子，一旦有血清加入，AP-1 就會呈現持續 活化的狀態。加入以一倍 DMEM 稀釋不同濃度的 TPA 溶液，作用 16 小時後，觀察 TPA 對細 胞中 AP-1 的作用。在 Chang liver/AP-1 細胞中濃度為 1 ng/mL 的 TPA 即可活化 AP-1 的活性 約為 2 倍(圖五，A)，而高於此濃度後，仍然有繼續上升的趨勢，到了濃度為 100 ng/mL 時約 可活化 6.5 倍。而 HepG2/AP-1 細胞則不易受到 TPA 的活化，TPA 的濃度大於 50 ng/mL 之後，
才有較明顯的活化的作用到了濃度為 100 ng/mL 時約可活化 2 倍(圖五，B)。
第二節 藥物對 TPA 誘發 Chang liver/AP-1 細胞 AP-1 活性的影響
細胞以前述方式繼代和去除血清培養以後，加入以一倍 DMEM 稀釋的藥物包含中藥的 甲醇萃取液，黃酮類、多酚類等和常用的抗癌藥物等。甲醇萃取液以千分之一的濃度，黃酮類 等植物的主要成份之最終濃度為 25 µM ，抗癌藥物其成份分為五大類（1）DNA 的烷化劑（2）
DNA 雙股的插入劑（3）Topoisomerase I 的抑制劑（4）Topoisomerase II 的抑制劑（5）鹼基的 類似物等，則以一倍的 DMEM 稀釋成 1 µM 的濃度，再加入濃度為 20 ng/mL 的 TPA，培養 16 小時後，以材料與方法所敘述的方式溶解細胞，測定冷光活性得到以下結果（圖六）。以 TPA 在細胞中活化的平均倍率為 1（紅色），藥物如果有抑制 TPA 所誘發 AP-1 的活性，會呈 現作用向冷色調（右方）移動的圖譜，反之則會向暖色調（左方）移動，20 ng/mL 的 TPA 約 可活化細胞中的 AP-1 活性達 14.5 倍，至於對抑制 Chang liver/AP-1 細胞 TPA 所誘發 AP-1 活 性的藥物，其植物分類對 AP-1 活性的影響和傳統藥性的區別，對 AP-1 活性的影響，在 508 種藥物對 TPA 所誘發 HepG2/AP-1 細胞 AP-1 活性的大量搜尋會把這兩種細胞做分析比較。
第三節 藥物對 TPA 所誘發 HepG2/AP-1 細胞活性的影響
細胞以前述的方式繼代和加藥作用 16 小時後，收取細胞的溶解液，測定冷光活性。以 TPA 在 HepG2/AP-1 細胞中活化的平均倍率為基準，觀察藥物對 TPA 誘發 AP-1 活性的影響，如果 藥物對 HepG2/AP-1 細胞中 TPA誘發的 AP-1 活性呈現抑制者，偏向冷色系；藥物對 HepG2/AP-1 細胞中 TPA 誘發的 AP-1 活性呈現活化者，偏向暖色系（圖七）。在第四節開始把藥物對 TPA 誘發 Chang liver/AP-1 及 HepG2/AP-1 細胞 AP-1 活性的作用，做植物分類學上，各個科別對兩 種不同肝細胞株中 TPA 誘發 AP-1 活性影響的比較；或是在不同的肝細胞株中皆有抑制 TPA 誘發 AP-1 活性能力的藥物，做以下的分析比較。
第四節 植物科別對兩種不同肝細胞株中 TPA 誘發 AP-1 活性的影響
在藥物庫中一共有 102 種不同科別的植物，除此之外尚有西藥、中藥複方、動物和礦物藥 等。因為動物藥有包含節肢、軟體、環節和哺乳動物們等動物組織入藥，牽涉較為複雜並且組 個數太少，在此部份沒有進一步去探討。分析方式以計算同一科別不同植物對 AP-1 的作用為 一個體，計算同一科別不同物種對 AP-1 影響的平均並計算標準差。在抗癌藥物的部份；有幾 種藥物在 Chang liver/AP-1 細胞中對 AP-1 沒有明顯的影響，但是在 HepG2/AP-1 細胞中，卻 會促使 TPA 誘發的 AP-1 活性高度活化，可能是因為 HepG2 細胞為開始癌化的細胞株，所以 會有不同的作用（圖八）。
藥物庫中屬於被子植物門，雙子葉植物，科別內有較多種植物的有：豆科、菊科、薔薇科、
芸香科、繖形科等。而單子葉植物的部份；在藥物庫中收集最多的為禾本科的植物，另外也有 真菌類入藥。在兩種肝細胞中對 TPA 誘發的 AP-1 活性皆呈現抑制作用的有：毛茛科
（Ranunculaceae）、小檗科（Berberidaceae）、蓼科（Polygalaceae）、桑寄生科（Loranthaceae）、
防巳科（Menispermaceae）、菫菜科（Violaceae）等。在較接近於正常的肝細胞的 Chang liver/AP-1 細胞呈現抑制，但是在 HepG2/AP-1 中對於 TPA 誘發的 AP-1 活性沒有抑制，呈現持平的有棕
活性沒有影響的有錦葵科（Malvaceae）、天南星科（Arecaceae）、旋花科（Convolvulaceae）、
桔梗科（Campanulaceae）等在兩種肝細胞中皆呈現活化 AP-1 作用的有鳶尾科（Iridaceae）、
報春花科（Primulaceae）等植物，但是因為有一些科別的植物在藥物庫中的個數不多，所以 還要在收集更多的植物才能下定論。另外在一些較多種植物樣本的科別如豆科、芸香科等則呈 現很大的岐異度；同一科別的不同種植物，有的對 TPA 誘發的 AP-1 呈現抑制作用，有的則沒 有差異或呈現活化的作用。有鑑於此，稍後會敘述在兩種不同的肝細胞株中，抑制 TPA 誘發 AP-1 活性的前十四名藥物的分析以及臨床之應用。
第五節 在 Chang liver/AP-1 和 HepG2/AP-1 細胞中皆能抑制 TPA 所誘發 AP-1 活性的前 十四名藥物的分析
由以上大量搜尋的結果中，選出抑制在兩種肝細胞中具有抑制 TPA 誘發 AP-1 活性的前 50 名藥物（結果在此不顯示），再選出兩種細胞中皆能抑制 AP-1 活性的藥物；使用以下的方 式分析藥物可能抑制 AP-1 活性的原因。分為科別、指標性成分、抑制 50 % AP-1 活性所需的 濃度（表一所顯示的為藥物在 HepG2/AP-1 細胞中，抑制一半 TPA 誘發 AP-1 活性所需的濃度）
（EC50）和臨床上的應用（複方）以求證搜尋系統的有效性（表一）。在科別的部份；十四種 藥物中有三種繖形科的植物（當歸、羌活，柴胡）芸香科的植物有兩種（黃柏、吳茱萸）和兩 種龍膽科的植物(龍膽、秦? ) 。 因為藥物庫中也有一部份的植物指標成分，也可做為雙重確 認。例如：黃連和黃柏都具有抑制 TPA 誘發 AP-1 活性的功能，而其中所含的有效物質：小檗 鹼( Berberine)也有相同的藥效。從此處也可以觀察到，有一些複方會同時使用以上幾種藥物，
除了證實搜尋系統的有效性，也可以指出一個未來的方向，包括複方的運用方式或是藥物的併 和使用會具有藥效加成的作用；另外，也可以使一些藥物開發新的使用途徑。
第六節 LPS 可以誘發 HepG2/NF--?B 細胞中 NF-?B 的活性
細胞繼代到 96 孔盤生長到全滿，LPS ( 5µg/µL)，以胎牛血清以 1:4 的比例稀釋，並以 37℃
在濃度大於 1 ng/mL 後，開始活化 HepG2 細胞的 NF-?B 轉錄活性；到了濃度為 10 ng/mL 時，
約可活化細胞中的 NF-?B 活性達 2 倍（圖九），在更高的濃度仍然可以持續活化細胞中的 NF--?B 活性；LPS 濃度為 100 ng/mL 時，NF-?B 約可活化 2.5 倍。以上的實驗經三次重複後，
決定以濃度 20 ng/mL 的 LPS，作為 HepG2 細胞中，抗 LPS 誘發 NF-?B 活性藥物的搜尋起點。
第七節 543 種藥物對 HepG2/NF-?B 細胞中 LPS 誘發的 NF-?B 活性之影響
細胞繼代到 96 孔盤經過 24 小時後，加入以一倍 DMEM 稀釋的藥物與 LPS，使其最終濃 度為含有千分之一稀釋的藥物和含有 20 ng/mL 的 LPS，經 16 小時後，收取細胞溶解液測定冷 光活性，並以 LPS 所活化的平均倍率作為基準（1 倍），表示藥物對 LPS 所活化的 NF-?B 活性 影響（圖十），並以能夠抑制 LPS 誘發 HepG2/NF-?B 細胞中 NF-?B 的活性，排名前 54 名的藥 物（結果在此不顯示）作為以下抗乙醛誘發 HepG2/NF-?B 細胞中 NF-?B 的活性藥物搜尋的起 點。
第八節 乙醛可以誘發 HepG2 細胞中 NF-?B 的活性
在較早期的前驅實驗中，選定以一倍 DMEM 稀釋成濃度為 0、50、100、200 µM 的乙醛與 HepG2/NF-?B 細胞作用觀察乙醛在 1、4、8 小時對細胞中 NF-?B 活性的影響發現以 8 小時，
50 µ? 的狀態下對 HepG2 細胞中 NF-?B 的活化效應最佳（結果在此不顯示）；在後續的實驗 中，HepG2/NF-?B 細胞以濃度為 50 µM 的乙醛刺激後，在 1、4、8、16、24 小時收集細胞的 溶解液，以 Reporter assay 的方法測量冷光的強度，觀察乙醛對 HepG2 細胞中 NF-?B 的活化 效應。在 HepG2/NF-?B 細胞中 NF-?B 的活性活化作用；乙醛在 4 小時，100 µM 的濃度下可 以活化 NF-?B 達到 1.9 倍；到了八小時，50 µM 時活化程度達到最高（圖十一，B）。乙醛活 化細胞中 NF-?B 的活性可以維持到 48 小時（圖十一，B）。為了進一步了解在八小時，何種濃 度的乙醛可以活化細胞中 AP-1 和 NF-?B 的活性達到最高，於是選用濃度為 1、5、10、25、
第九節 54 種藥物對乙醛誘發 HepG2 細胞中 NF-?B 活性的影響
由（圖十一）的結果，得知乙醛可以誘發 HepG2 細胞中 NF-?B 的活性，於是從 543 種藥 物（圖四）對 LPS 所誘發 HepG2 細胞中 NF-?B 活化的影響，在以上抑制的 LPS 誘發
HepG2/NF-?B 細胞中 NF-?B 的活性，排名前 54 名的藥物；包含中藥的甲醇萃取液、各種不同 成份之生藥主成分（含黃酮類、生物鹼、皂素類、多酚類等成份）以及抗癌藥物（結果在此不 顯示）。藥物的作用濃度，分為 1/1000 (v/v)，25 µ? 及 1 µ? 。乙醛濃度則為 50 µM，加入細胞 中培養 8 小時後，以 Reporter assay 測定藥物對細胞中 NF-?B 活性的影響（圖十二），在以上 54 種藥物中，黃連、黃柏、和小檗鹼都能抑制肝細胞中乙醛誘發的 NF-?B 活性，尤其以小檗鹼 的效果最好，相對 EC50濃度約為 18.0±1.8 µM（結果在此不顯示）；由於黃連、黃柏等植物內 主要活性成分為小檗鹼（4~7 %），所以決定選出小檗鹼做以下的研究。
第十節 小檗鹼可以抑制 HepG2 細胞中被乙醛誘發的 NF-?B 的活性
細胞培養於 25T flask 中，分別加入一倍 DMEM 稀釋，濃度為 1、5、25、50、100 µM 的 小檗鹼 30 分鐘後，加入濃度為 5 µ? 的乙醛，經過八小時後以 Reporter assay 測定細胞中轉錄 因子的活性，小檗鹼在濃度為 1 µM 時即能開始抑制細胞中 NF-?B 的活性；其抑制細胞中 50 % NF-?B 活性的濃度（EC50）為 18.0±1.8 µM（圖十三），由實驗可知小檗鹼對乙醛誘發肝細胞中 NF-?B 的活化具有抑制作用。
第十一節 小檗鹼可以抑制 HepG2 細胞中乙醛誘發之 I-?B 磷酸化
乙醛在 HepG2 細胞中活化 NF-?B 上游之訊息傳導路線，主要是經由 I-?B 的磷酸化，並 造成 NF-?B 分離，使 NF-?B 由細胞質進入細胞核發揮活性(Juan et al., 2000)。由以上 reporter assay的結果，得知小檗鹼可以抑制細胞中乙醛所誘發的 NF-?B 活化。為了了解小檗鹼對 NF-?B
乙醛在 HepG2 細胞中活化 NF-?B 上游之訊息傳導路線，主要是經由 I-?B 的磷酸化，並 造成 NF-?B 分離，使 NF-?B 由細胞質進入細胞核發揮活性(Juan et al., 2000)。由以上 reporter assay的結果，得知小檗鹼可以抑制細胞中乙醛所誘發的 NF-?B 活化。為了了解小檗鹼對 NF-?B