2 – 1 巨噬細胞細胞株之培養流程
本實驗所用之白血球細胞為老鼠巨噬細胞株 RAW 264.7 (BCRC number: 60001, ATCC number: TIB-71)，是一個標準用來研究巨噬細胞表現系統的細胞株。培養步驟如 下64, 65：
步驟1：培養基 (medium) 的配製，將 1000 mL 的 DMEM (11965, Invitrogen, U.S.A) 加入 10% 胎牛血清 (FBS, 26140, Invitrogen, U.S.A)) 及 1% 青黴素 - 鏈黴 素溶液 (PS, 10378, Invitrogen, U.S.A)，混合均勻後通 0.2 μm 的濾網過濾掉 細菌。
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步驟 2：將細胞解凍後加培養基至 5 mL，並移到 polystyrene 材質之 25T 長頸 瓶 (flask, 353108, BD Falcon, U.S.A)，最後放到 37 oC，5% CO2 的培養箱 (Incubator, NU-5500, Nuaire, U.S.A)。
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步驟 3：當細胞數達到培養盤面積 70 ~ 80% 時進行繼代培養 (取 10% 細胞至新培 養盤繼續培養)。
DMEM 1000 mL 10% FBS
1% PS
37oC 5% CO2
圖 2 – 1 巨噬細胞細胞株 (RAW 264.7) 之培養流程。
2 – 2 酵母菌之培養流程
本實驗所使用之酵母菌為 Pichia pastoris (X-33, Invitrogen, U.S.A)，因其生長速率 快、容易培養在簡單的培養基內，並且也很適應一般的培養條件，是常被用來當蛋白質 表現的模型系統之ㄧ66, 67。
步驟1：培養基 (medium) 的配製，將 100 mL 的 DI water 倒入三角燒瓶中，再 加入 meat peptone 2g、酵母萃取物 (yeast extract) 1g 與葡萄糖 (glucose)
1g，再攪拌混合之。
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步驟2：將燒瓶用錫箔紙緊密蓋住後，連同配好的培養基置入高溫高壓滅菌鍋內，
以高溫高壓 (120 , 15 psi)℃ 滅菌 60 min，用以除去可能存在的微生物。
滅菌完成後，並待其溫度回到室溫。
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步驟3：取 5 mL 之培養基溶液置入試管內，並取適量的酵母菌接種至試管中。
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步驟4：將試管放入旋轉式細胞培養儀中，在室溫下 (25 ℃~28 ℃) 培養 12 小時。
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步驟5：12 小時後，將試管取出，此時應可在試管底部周圍發現有白色的沉澱 物，即為酵母菌。
DI water 100 mL meat peptone 2 g
yeast extract 1 g glucose 1 g
120 oC 15 psi 60 min
25 oC ~ 28 oC 12 hours
圖 2 – 2 酵母菌 (Pichia Pastoris) 之培養流程。
2 – 3 同位素標定酵母菌之流程
在同位素標定的部份，我們知道生物體內很多代謝過程都涉及水的利用，例如脂肪 酸的分解、糖解作用 (G6P 轉變成 F6P)、檸檬酸循環 (延胡索酸轉變成蘋果酸、異檸 檬酸轉變成琥珀酸)。所以，如果我們將原本培養酵母菌的去離子水，更換成重水，將 可能藉由重水被代謝的結果，而將氫或氫氧基取代成氘或氘氧基。因此，在此同位素標 定過程，其步驟和一般酵母菌的培養相同，唯一的差別只在培養基 (medium) 的配製。
在培養基裡，我們將原本的去離子水更換成重水 (D2O,151882-100G, Sigma-Aldrich)，其 他成分 (酵母菌萃取物、葡萄糖、meat peptone) 仍維持同樣的量。希望透過較自然的方 式讓酵母菌具有同位素訊號，而不至於對其生長造成太大影響。
而在同位素取代過後酵母菌之拉曼光譜量測，我們會在實驗中所需之各時間點，將 處於重水製備之培養液內的酵母菌離心 (1100 rpm, 6 min)，除去帶有重水之培養液，並 以緩衝溶液 (PBS) 沖洗並離心兩次，最後保存在緩衝溶液內以量取光譜。
2 – 4 雷射共焦自體螢光顯微鏡技術應用於巨噬細胞吞噬酵母菌 之動態成像
為了獲取細胞內自體螢光隨吞噬過程的變化，我們利用 FV300 共焦顯微鏡 (Olympus, Japan) 來達成此目的，使用的光源為 488 nm 之氬離子雷射 (CVI Melles Griot, USA)，搭配使用的物鏡為 60 倍水鏡 (UPLSAPO 60XW, N.A. = 1.20, Olympus, Japan)。掃描時所用的雷射強度約為 1 mW，每張影像為 15 次掃描 (1.65 s/frame) 的平 均，掃描範圍約 60 μm×60 μm (512 pixels×512 pixels)，共焦光圈大小為 100 μm。使用 的偵測器為 R7400U-02 (Hamamatsu, Japan)，並在偵測器前利用 510 nm 以上波長穿透 的長波長穿透濾鏡 (BA510IF,Olympus, Japan)，收集在 500 ~ 750 nm 間來自黃素蛋白的 自體螢光 68。影像中強度的分析及橫截面強度分析則是利用 Fluoview (Olympus, Japan)。在影像強度分析上，我們在每個掃描區域上均作 9 層之深度 (z 軸) 掃描 (每 層間隔 0.5 μm)，再從此 9 張影像中挑選強度最強的一張，並找影像中細胞邊界清晰者 來做比較，以細胞扣除細胞核後的影像強度及面積大小之比值為比較值。而橫截面強度 分析方面，我們以挑選後之截線兩旁各兩影像點 (pixel) 的強度作平均，因此每一個數 據點之強度為鄰近五個點的平均結果。
2 – 5 拉曼散射光譜技術應用於量測酵母菌於巨噬細胞內及細胞 外之氧化傷害
本論文中拉曼光譜的量測，所使用的是實驗室自行架設的系統，相關設備如下 (圖
2 – 3)。激發光源的部份，我們選用波長為 532 nm 的綠光固態雷射 (532-25, DPSS, USA)，並利用邊境濾光片 (edge filter, LP03-532RU-25, Semrock, U.S.A) 及反射鏡將雷 射光引入顯微鏡 (IX71, Olympus, Japan)，靠著高 N.A. 值的物鏡 (UPLSAPO 100X Oil, Olympus, Japan) 將雷射光高度聚焦至樣品上。產生的 Stokes scattering 會經由同一個物 鏡被收集並通過邊境濾光片。在邊境濾光片之後為一個 25 μm 之共軛焦光圈 (confocal pinhole)。最後，我們透過光纖將訊號傳送至光譜儀 (SR-303i-A, Andor Technology, U.S.A)，經過光譜儀分光處理後，再利用置於光譜之後的電荷耦合元件 (Charge-coupled Device, CCD, iDus DV420A-OE, Andor Technology, U.S.A) 收集光譜訊號，並由電腦來接 收 CCD 獲得的光譜訊號。另外，由於我們也需要透過顯微鏡的亮視野影像 (bright field image) 來找尋樣品的位置，所以我們架設一個 CCD (Wat-902H, Watec, Japan) 於顯微鏡 上，並將影像即時傳送至顯示器及電腦上。
在光譜的擷取條件，我們所使用的雷射強度為 7 mW (於物鏡聚焦後量測)，光譜的 積分時間為 30 秒。另外，在白血球細胞內的實驗，每個擷取時間點皆只取一張光譜，
且間隔時間內雷射會關閉，並不持續施加雷射在細胞上。而在細胞外模擬的部份，我們 持續抓取同一個酵母菌 35 ~ 45 分鐘，光譜積分時間仍是 30 秒，而最後呈現光譜是 5 張光譜的平均 (例如第一張是 30 ~ 150 秒所取光譜的平均)。
CCD
Telescope ND FilterND Filter 100x N.A. 1.4100x N.A. 1.4 Oil ImmersionOil Immersion
Monitor PC